EZH2抑制劑DZNEP影響人頭頸部鱗癌增殖與凋亡的體內(nèi)外研究

孔令平，周旋，孫姍姍，黃媛媛，張侖

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院頜面部耳鼻喉科，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300060）

論著

EZH2抑制劑DZNEP影響人頭頸部鱗癌增殖與凋亡的體內(nèi)外研究

孔令平，周旋，孫姍姍，黃媛媛，張侖

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院頜面部耳鼻喉科，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300060）

目的：探討Zeste同源序列2的增強(qiáng)子（EZH2）的小分子抑制劑DZNEP抑制人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Tb3.1增殖、誘導(dǎo)凋亡的效果與機(jī)制。方法：甲基噻唑基四唑（MTT）法測(cè)細(xì)胞對(duì)DZNEP的半數(shù)致死量（IC50）、細(xì)胞的增殖能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；平板克隆法檢測(cè)細(xì)胞形成克隆能力；JC-1熒光探針染色法檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位；蛋白質(zhì)印跡法（WB）檢測(cè)EZH2、細(xì)胞增殖核抗原（Ki－67）、B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl－2、BAX）、活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（CCASP－3）的表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)裸鼠皮下荷瘤模型，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色及原位末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測(cè)DZNEP對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的作用。結(jié)果：經(jīng)DZNEP處理后，EZH2蛋白表達(dá)降低；MTT法檢測(cè)DZNEP明顯抑制鱗癌細(xì)胞Tb3．1的增殖，且具有濃度和時(shí)間依賴性；流式細(xì)胞術(shù)顯示DZNEP可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；平板克隆實(shí)驗(yàn)表明DZNEP能夠明顯抑制克隆形成能力，抑制細(xì)胞增殖；JC－1熒光探針染色法顯示DZNEP可以改變細(xì)胞的線粒體膜電位；WB顯示，DZNEP可增加促凋亡基因（CCASP－3、BAX）的表達(dá)，抑制Ki－67、Bcl－2的表達(dá)水平。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)束時(shí)，DZNEP處理組腫瘤體積較對(duì)照組明顯減小。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果示，DZNEP組中BAX、CCASP－3表達(dá)增加，Ki－67、Bcl－2表達(dá)減少；TUNEL結(jié)果顯示，DZNEP組比DMSO組腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)上升。結(jié)論：DZNEP通過(guò)抑制EZH2表達(dá)在體外抑制Tb3.1細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡；為進(jìn)一步探討EZH2參與人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌；EZH2；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞增殖

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌是頭頸部癌中最常見(jiàn)的病理類型。目前研究認(rèn)為，表觀遺傳調(diào)控紊亂是頭頸部鱗癌的重要特征。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2是表觀遺傳調(diào)控蛋白PRC2復(fù)合物的重要組成部分，它可以作為聯(lián)系DNA甲基化與組蛋白乙酰化、甲基

化等其他表觀遺傳修飾的橋梁[1]。EZH2特異性的使組蛋白H3的第27位點(diǎn)的賴氨酸三甲基化（H3K27me3）從而使下游靶基因沉默[2]。在頭頸部鱗癌中針對(duì)EZH2靶向治療的研究尚屬空白,據(jù)此,選用EZH2小分子抑制劑DZNEP作為抑制頭頸部鱗癌細(xì)胞系Tb3.1中EZH2的藥物，開展了以下實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 材料 人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Tb3.1（上海交通大學(xué)第九人民醫(yī)院惠贈(zèng)）。DZNEP購(gòu)于Cayman公司。DMSO、MTT購(gòu)于Sigma公司。凋亡試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。線粒體膜電位試劑盒購(gòu)于碧云天生物科技有限公司。RIPA裂解液購(gòu)于Millipore公司。EZH2、CCASP-3購(gòu)于CST公司，Bcl-2、BAX、Ki-67、GAPDH及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)于中杉金橋生物科技有限公司。組化用生物素標(biāo)記的二抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的三抗購(gòu)于中杉金橋生物科技有限公司。裸鼠購(gòu)自北京維通利華。TUNEL原位凋亡試劑盒購(gòu)自Roche公司。0.25%胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清（Hyclone，美國(guó)）的1640（Gibco，美國(guó)）完全培養(yǎng)基,置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)濕潤(rùn)培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 空白對(duì)照組；DMSO組：在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入與DZNEP組等劑量的DMSO；實(shí)驗(yàn)組（DZNEP組）：將DZNEP（溶于DMSO）加入細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，使其終濃度為3 μmol/L。

1.2.3 MTT法檢測(cè)DZNEP對(duì)頭頸部鱗癌細(xì)胞株的抑制作用 取104個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種至96孔板，設(shè)有空白對(duì)照（不含細(xì)胞，只加相應(yīng)培養(yǎng)液），陰性對(duì)照（只有細(xì)胞懸液），每組重復(fù)5次；實(shí)驗(yàn)組（DZNEP濃度分別為0.1、0.5、1、2、4、6、8、10 μmol/L）每種濃度重復(fù)5次。培養(yǎng)24h后加入20μL（5mg/mL）MTT（公司，美國(guó)），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加200 μL DMSO，用紫外分光光度計(jì)490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光度（A值），取每組5孔的均值。根據(jù)結(jié)果制作生長(zhǎng)曲線，并計(jì)算IC50。

1.2.4 MTT法檢測(cè)DZNEP對(duì)頭頸部鱗癌細(xì)胞株隨時(shí)間的抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Tb3.1細(xì)胞以104個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，按1.2.2所述處理細(xì)胞，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔；分別于實(shí)驗(yàn)0、1、2、3、4、5 d行MTT檢測(cè)，用490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光度，取每組5孔的均值。按照公式計(jì)算各組細(xì)胞生存率=（處理組細(xì)胞吸光度值/空白對(duì)照組細(xì)胞吸光度值）×100%，并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 膜聯(lián)蛋白 5-碘化丙啶法檢測(cè)細(xì)胞凋亡DZNEP處理細(xì)胞48 h后，將細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液,按照試劑盒說(shuō)明先后加入膜聯(lián)蛋白5、碘化丙啶后使用熒光激活細(xì)胞分揀儀 (fluorescenceactivated cell sorting Calibar,FACS Calibar)（BD，美國(guó)）檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖克隆能力 制備單細(xì)胞懸液。用吸管反復(fù)吹打細(xì)胞懸液，使細(xì)胞充分分散至單細(xì)胞百分率>95%，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)；分別按細(xì)胞為1 000/孔接種于6孔板中搖勻；37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)14 d，倒置相差顯微鏡下網(wǎng)格目鏡隨機(jī)選擇3個(gè)100×視野下大網(wǎng)格內(nèi)計(jì)算細(xì)胞克隆數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 Western blot檢測(cè)DZNEP對(duì)頭頸部鱗癌細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 分別按1.2.2所述處理Tb3.1細(xì)胞48 h后，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，加入1/3體積的4×SDS上樣緩沖液混勻并煮沸變性。EZH2、Bcl-2、BAX、Ki-67、CCASP-3，GAPDH一抗（1∶1 000稀釋）4℃搖床孵育過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2 000稀釋）室溫孵育1 h，洗去二抗，凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國(guó)）采集圖像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 線粒體膜電位試劑盒(JC-1)檢測(cè)DZNEP對(duì)線粒體膜電位的影響 常規(guī)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Tb3.1接種在共聚焦小皿中，用1.2.2所述方法處理細(xì)胞48 h，吸除培養(yǎng)液后加入500 μL培養(yǎng)液及500 μL JC-1染色工作液，放入37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min。孵育結(jié)束后吸除上清，再用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為4周齡雌性裸鼠，飼養(yǎng)于中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)血液學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。制備細(xì)胞密度為5×1010個(gè)/L的Tb3.1單細(xì)胞懸液200 μL，分別接種于15只裸鼠左側(cè)腹股溝皮下。成瘤后，隨機(jī)分為3組，每組5只。分別用20 μL DZNEP和DMSO瘤內(nèi)注射。3 d治療1次并測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑(a)及寬徑(b)，腫瘤體積計(jì)算公式：V=（ab2）/2，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。于最后一次腫瘤測(cè)量結(jié)束后，處死裸鼠，取出裸鼠皮下荷瘤，固定，石蠟包埋，制備切片。

1.2.10 免疫組化檢測(cè)及結(jié)果判斷 石蠟切片脫蠟水化，抗原修復(fù)，3%H2O2孵育15 min，山羊血清封閉，分別滴加BAX、CCASP-3、Bcl-2、Ki-67一抗（1∶100稀釋）4℃孵育過(guò)夜；加入生物素標(biāo)記的二抗（1∶100稀釋）37℃孵育40 min；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的三抗（1∶100稀釋）37℃孵育40 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染10 min，脫水，封片；DP-70倒置顯微鏡（Olympus，日本）采集圖像。

1.2.11 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 切片脫蠟水化，按照TUNEL原位凋亡試劑盒說(shuō)明書實(shí)驗(yàn)。激光掃描共聚焦顯微鏡（Olympus，日本）采集圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法測(cè)定頭頸部鱗癌細(xì)胞株DZNEP的半數(shù)抑制濃度（IC50） MTT結(jié)果顯示：DZNEP的濃度越高，Tb3.1的吸光度值越小，活細(xì)胞數(shù)量也就越小，說(shuō)明具有濃度依賴性。經(jīng)SPSS軟件計(jì)算分析頭頸部鱗癌細(xì)胞株Tb3.1的IC50為3 μmol/L。

2.2 WB檢測(cè)DZNEP對(duì)Tb3.1細(xì)胞中EZH2蛋白表達(dá)的影響 WB結(jié)果顯示：DZNEP處理后，Tb3.1細(xì)胞株的EZH2蛋白表達(dá)降低，空白對(duì)照組、DMSO組、DZNEP組的相對(duì)表達(dá)量分別為0.97±0.11、0.94± 0.11、0.28±0.03，且DZNEP組與DMSO和空白對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1），說(shuō)明DZNEP具有抑制EZH2表達(dá)的作用。

圖1 DZNEP處理Tb3.1后EZH2蛋白的表達(dá)Fig 1 DZNEP affects the expression of EZH2 in Tb3.1

2.3 MTT法檢測(cè)Tb3.1細(xì)胞生存率 MTT結(jié)果顯示：MTT第4天，DZNEP組細(xì)胞存活率最低[（33±5）%]，低于空白對(duì)照組（100%）、DMSO組[（90±2）%]（P＜0.05）（表1），說(shuō)明DZNEP處理后，Tb3.1的增殖能力明顯減弱，且具有時(shí)間依賴性。

表1 不同時(shí)間細(xì)胞生存率(%±s)Tab 1 Cell viability at different times(%，±s)

表1 不同時(shí)間細(xì)胞生存率(%±s)Tab 1 Cell viability at different times(%，±s)

*代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

分組空白對(duì)照組DMSO組DZNEP組樣本數(shù)555 FP細(xì)胞生存率第0天第1天第2天第3天第4天第5天100 100 100 100 100 100 99±2 97±2 94±1 93±2 90±2 89±5 97±1 70±3*57±13*47±10*33±5* 37±4* 2.761 148.889 26.336 73.669 475.459266.664 0.141 0.000 0.001 0.000 0.000 0.000

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 流式結(jié)果顯示：DZNEP組 [（20.67±4.61）%]較空白對(duì)照組 [（1.33± 0.24）%]和DMSO組[（1.51±0.33）%]凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2），說(shuō)明DZNEP可誘導(dǎo)Tb3.1發(fā)生凋亡。

圖2 DZNEP處理后Tb3.1細(xì)胞凋亡比例柱形圖Fig 2 DZNEP induces cell apoptosis

2.5 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DZNEP處理后Tb3.1的克隆形成能力 結(jié)果顯示：每100 mm2視野中，DZNEP處理組克隆形成數(shù)目（1±1）明顯低于空白對(duì)照組（12±3）及DMSO組（10±2），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

圖3 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DZNEP處理后克隆形成Fig 3 Clone formation ability reduced after DZNEP treatment

2.6 JC-1熒光法檢測(cè)DZNEP對(duì)線粒體膜電位的影響 當(dāng)線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)內(nèi)，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)內(nèi)，此時(shí)為JC-1單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。結(jié)果顯示：DZNEP處理后Tb3.1細(xì)胞線粒體膜電位明顯處于較低水平，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡（圖4）。

圖4 JC-1熒光探針檢測(cè)線粒體膜電位情況Fig 4 Mitochondrial membrane potentials reduced by DZNEP

2.7 WB檢測(cè)DZNEP對(duì)Tb3.1生長(zhǎng)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果顯示：促增殖因子Ki-67及抑制凋亡因子Bcl-2的表達(dá)明顯被DZNEP抑制，而DZNEP可以增加促凋亡因子CCASP-3、BAX的表達(dá)，并且DZNEP組與DMSO組和空白對(duì)照組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。提示DZNEP處理后，細(xì)胞增殖能力降低，并且誘導(dǎo)促凋亡蛋白增加，促進(jìn)凋亡。

表2 DZNEP處理后Tb3.1凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s）Tab 2 Relative expression of apoptosis-relatead protein after DZNEP treatme（±s）

表2 DZNEP處理后Tb3.1凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s）Tab 2 Relative expression of apoptosis-relatead protein after DZNEP treatme（±s）

細(xì)胞系 蛋白 蛋白相對(duì)表達(dá)量 F P空白對(duì)照組 DMSO組 DZNEP組Tb3.1 Ki-67 0.44±0.020 0.44±0.030 0.05±0.002 429.829 0.000 CCASP-3 0.45±0.020 0.42±0.030 1.13±0.060 357.773 0.000 Bcl-2 0.60±0.030 0.63±0.020 0.13±0.004 547.480 0.000 BAX 0.06±0.002 0.05±0.002 0.47±0.020 951.621 0.000

2.8 裸鼠皮下荷瘤生長(zhǎng)曲線 DZNEP組裸鼠皮下荷瘤體積（1 047.6±397.7）mm3小于空白對(duì)照組（2 708.8±859.9）mm3和DMSO組（2 384.2±873.3）mm3（圖5）。說(shuō)明DZNEP可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

圖5 裸鼠皮下荷瘤生長(zhǎng)曲線Fig 5 Subcutaneously tumor-burdened growth curve

2.9 TUNEL實(shí)驗(yàn) 圖6示DAPI藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞核，F(xiàn)luorescein-dUTP標(biāo)記：斷裂DNA的3’-OH末端，488 nm激發(fā)波長(zhǎng)下可在共聚焦顯微鏡下看到細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光。顯微鏡下,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野（×400）統(tǒng)計(jì)凋亡指數(shù)。DZNEP處理組凋亡指數(shù)為[（34．8±3．2）%]多于空白對(duì)照組凋亡指數(shù)[（5．9± 1．7）%]和DMSO組凋亡指數(shù)[（8．3±1．9）%]，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說(shuō)明DZNEP組細(xì)胞凋亡數(shù)較DMSO組和空白對(duì)照組明顯增加。

2.10 免疫組化染色檢測(cè)裸鼠皮下荷瘤生長(zhǎng)相關(guān)蛋白的表達(dá) EZH2及Ki-67陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞核，DZNEP處理組兩種蛋白均呈弱陽(yáng)性表達(dá)；而促凋亡基因BAX和CCAP-3的陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)中，DZNEP處理組兩種蛋白均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；抗凋亡基因Bcl-2陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞漿中，DZNEP組陽(yáng)性信號(hào)顯著減弱（圖7）。

圖6 DZNEP處理后腫瘤組織細(xì)胞的凋亡情況（SP×1 000）Fig 6 Apoptotic nucleus in DZNEP-treated tumors detected by TUNEL assay（SP×1 000）

圖7 DZNEP處理后裸鼠皮下荷瘤生長(zhǎng)相關(guān)蛋白的表達(dá)（SP×200）Fig 7 IHC staining of tumor growth-relatead protein expression（SP×200）

3 討論

在過(guò)去10年里，盡管手術(shù)、化療以及放射治療等多種治療頭頸部癌的方法取得了巨大的進(jìn)展，但頭頸部鱗癌的5年生存率仍然不令人滿意[3-4]。因此尋找頭頸部鱗癌有效的靶向治療成為研究熱點(diǎn)。研究表明細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，多數(shù)腫瘤中細(xì)胞凋亡受阻，凋亡信號(hào)通路紊亂導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡減少，進(jìn)而發(fā)生異常增殖[5]。因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡可作為治療腫瘤的新靶點(diǎn)。

組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2在多種腫瘤中異常高表達(dá)，它可以使多個(gè)抑癌基因表達(dá)沉默，其中包括促凋亡基因及抑制細(xì)胞增殖的基因，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[6]。目前EZH2在頭頸部鱗癌中的研究較為廣泛，據(jù)報(bào)道EZH2的高表達(dá)與腫瘤的生長(zhǎng)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期以及不良預(yù)后均有密切聯(lián)系[7]；EZH2還具有促進(jìn)口腔黏膜白斑惡化、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及保證癌癥干細(xì)胞狀態(tài)的作用[8]。然而EZH2與頭頸部腫瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)系尚不明確，因此我們選用EZH2小分子抑制劑DZNEP（3-deazaneplanocin A）進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。

DZNEP是一種競(jìng)爭(zhēng)性的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑，它可以抑制瘤細(xì)胞中EZH2的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用。近來(lái)在肺癌、胃癌、骨髓瘤、急性髓性白血病以及淋巴瘤等癌癥的實(shí)驗(yàn)研究中，DZNEP均有希望成為抑制腫瘤生長(zhǎng)的藥物[9-13]。研究發(fā)現(xiàn)在多種惡性血液病中，DZNEP具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用[14]。該研究主要對(duì)頭頸部鱗癌細(xì)胞系進(jìn)行了增殖和凋亡的檢測(cè)。Chiba等[15]研究發(fā)現(xiàn)用干擾RNA或者DZNEP抑制EZH2的表達(dá)均可使肝癌細(xì)胞系細(xì)胞增殖速度、克隆形成數(shù)量明顯低于對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)中DZNEP組Tb3.1細(xì)胞增殖及克隆形成的數(shù)量明顯較對(duì)照組低，說(shuō)明DZNEP抑制頭頸部鱗癌細(xì)胞增殖及克隆形成。在多發(fā)性骨髓瘤中，DZNEP可抑制抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl的表達(dá)，使促凋亡基因Caspase-3活化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率較對(duì)照組升高[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示早期凋亡率明顯增高，DZNEP抑制Tb3.1細(xì)胞Bcl-2表達(dá)，減少其與BAX結(jié)合，使BAX表達(dá)增多，促進(jìn)促凋亡基因Caspase-3的活化，誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。另外，線粒體跨膜電位的破壞被廣泛地認(rèn)為細(xì)胞凋亡過(guò)程中最早發(fā)生的事件，實(shí)驗(yàn)中DZNEP可使線粒體跨膜電位破壞增多誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在裸鼠荷瘤模型實(shí)驗(yàn)中，DZNEP處理組促凋亡基因BAX及CCASP-3表達(dá)水平明顯上調(diào)，而拮抗凋亡基因Bcl-2及促增殖基因 Ki-67表達(dá)明顯下調(diào)；Tunel實(shí)驗(yàn)證明了DZNEP在體內(nèi)仍可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

盡管目前有許多促癌及抑癌基因可作為頭頸部鱗癌發(fā)生發(fā)展的預(yù)測(cè)因子，然而還沒(méi)有一種可作為病人診斷、治療及預(yù)后等綜合處理的理想因子。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)研究證明異常高表達(dá)的EZH2可拮抗多種癌癥的化療作用[16]。如上所述，通過(guò)DZNEP的作用，頭頸部鱗癌細(xì)胞Tb3.1的增殖能力被抑制，同時(shí)凋亡能力明顯增高。因此，我們認(rèn)為以EZH2為靶點(diǎn)治療頭頸部鱗狀細(xì)胞癌可能成為一種新的治療方向，這還需要進(jìn)一步地探討及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究為DZNEP的臨床應(yīng)用研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（2015-06-01收稿）

DZNEP inhibits cell proliferation and induces apoptosis by targeting EZH2 in human head and neck squamous cell carcinoma in vitro and vivo

KONG Ling-ping,ZHOU Xuan,SUN Shan-shan,HUANG Yuan-yuan,ZHANG Lun
（Department of Maxillofacial&Ear,Nose,and Throat oncology,Cancer Institute and Hospital,Tianjin Medical University,National Clinical Research Center for Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060,China）

Objective：To investigate the anti-tumour molecular mechanism of DZNEP in human head and neck squamous cell carcinoma.Methods：Tb3.1 human head and neck squamous cell carcinoma cell lines were employed.DZNEP was used to suppress the expression of EZH2.Methyl thiazolyl tatrozolium(MTT)assay was applied to determine IC50and cell survival.Flow cytometry(FCM)was used to measure cell apoptosis.JC-1 fluorescence was employed to determine MMP.The expression level of EZH2,antigen 67(Ki-67),B cell lymphoma 2 (Bcl-2,BAX)and cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-3(CCASP-3)were examined by Western blotting.Results：Compared with control and normal control cells,DZNEP inhibited EZH2 expression and affected cell proliferation.Apoptosis rate was elevated by DZNEP. Clone formation assay suggested that cell clone numbers were significantly reduced by DZNEP.BAX and CCASP-3 expression were enhanced by DZNEP treatment,while Ki-67 and Bcl-2 expression were suppressed.In vivo,the tumor volume after treatment with DZNEP was significantly smaller than control groups.Immunological histological chemistry suggested that BAX and CCASP-3 protein expression was up-regulated while Ki-67 and Bcl-2 protein of tumor tissue was down-regulated after treated DZNEP as compared to control groups. TUNEL assay indicated that apoptosis index was increased after treatment with DZNEP compared with control groups.Conclusion：DZNEP modulates proliferation and apoptosis of Tb3.1 cancer cell by inhibiting EZH2,which might promote further research in head and neck squamous cell carcinoma treatment.

head and neck squamous cell carcinoma;EZH2;apoptosis;proliferation

R739.91

A

1006－8147（2015）06-0461-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81172573）

孔令平（1988-）,女,碩士在讀，研究方向：頭頸部鱗癌的基礎(chǔ)研究;通信作者：張侖，E-mail：zhanglun@tjmuch.com。