人附睪蛋白4在乳腺癌發生發展中的機制研究

周巖，宋偉杰，張飛，冀為，田然，牛瑞芳，黎小沛

（1．天津醫科大學腫瘤醫院，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，腫瘤研究所公共實驗室，天津300060；2.天津醫科大學基礎醫學院，天津300070）

論著

人附睪蛋白4在乳腺癌發生發展中的機制研究

周巖1，宋偉杰1，張飛1，冀為1，田然1，牛瑞芳1，黎小沛2

（1．天津醫科大學腫瘤醫院，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，腫瘤研究所公共實驗室，天津300060；2.天津醫科大學基礎醫學院，天津300070）

目的：探討人附睪蛋白4（HE4）在乳腺癌發生發展中的機制研究。方法：采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測15例原發乳腺癌組織及其配對的癌旁正常組織中HE4 mRNA的表達水平。RT-qPCR和Western blot檢測常見乳腺（癌）細胞系中HE4 mRNA和蛋白表達水平。通過RNA干擾技術沉默HE4高表達的乳腺癌SKBR3細胞中HE4表達，通過CCK8和克隆形成實驗分析沉默HE4表達對SKBR3細胞增殖的影響。流式細胞術檢測沉默HE4表達對SKBR3細胞凋亡的影響。Western blot檢測沉默HE4表達對Erk和Akt磷酸化水平的影響。結果：HE4 mRNA在乳腺癌組織中高表達；沉默HE4表達抑制乳腺癌細胞SKBR3細胞增殖能力并促進其凋亡，Erk和Akt蛋白磷酸化水平降低。結論：HE4通過影響Erk和Akt信號通路促進乳腺癌發生發展。

人附睪蛋白4；乳腺癌；增殖；凋亡

乳腺癌是嚴重威脅婦女健康的惡性腫瘤，其發病率及死亡率在我國均呈上升趨勢。乳腺癌的發生發展是一個多基因參與的復雜的演變過程，其病因及機制尚未完全闡明。因此，研究乳腺癌發生發展的分子機制是建立其早期診斷和治療的重要途徑，對提高患者生存具有重要意義。人附睪蛋白4（human epididymis protein 4，HE4），其編碼基因位于20q12～13q.1，編碼124個氨基酸的HE4蛋白前體。該蛋白含有由8個半胱氨酸和4個二硫鍵組成的，高度保守的WAP（Whey Acidic Protein）結構域。目前關于HE4的研究集中在卵巢癌的早期篩查、診斷和預后評價，其在乳腺癌中的作用鮮有報道。本研究探討HE4在乳腺癌組織中的表達情況及其與乳腺癌發生發展的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 收集天津醫科大學腫瘤醫院2005年2月-2006年8月原發乳腺癌組織及配對的癌旁正常組織各15例。均為術中立即取材，組織標本立即凍存于-80℃冰箱中。

1.1.2 試劑 Lipofectamine 2000、cDNA SuperScript II Reverse Transcriptase、Fast SYBR Green Master MixSystem、Trizol、RPMI-1640、DMEM/F12、胎牛血清、馬血清等購于Life Technologies公司。HE4抗體購于Abcam公司，Erk、AKT、p-Erk和p-AKT抗體購于Cell Signaling公司，β-actin抗體購于Sigma公司。CCK8試劑盒購于Takara公司，HE4 siRNAs購于上海吉凱公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人乳腺上皮細胞MCF10A、乳腺癌細胞MCF7、MDA-MB-231和SKBR3購于中國生命科學院上海細胞庫。MCF10A細胞培養于含有5%馬血清、10 μg/mL胰島素、0.5 μg/mL氫化可的松、20 ng/mL EGF和100 ng/mL霍亂毒素的DMEM/ F12培養基中，MCF7、MDA-MB-231和SKBR3培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640中。所有培養基含有1%青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 μg/ mL），于含5%CO2的37℃恒溫培養箱中培養。

1.2.2 細胞轉染 轉染前一天將5×105個細胞接種于6孔板，無抗生素培養基培養，采用Lipofectamine 2000轉染試劑，按說明書進行操作，轉染后6 h換為新鮮培養基，進行后續實驗。

1.2.3 RNA的提取 采用Trizol試劑提取組織標本或細胞總RNA，微量核酸定量分析儀測定濃度并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。

1.2.4 逆轉錄熒光定量PCR 采用cDNASuperScript IIReverseTranscriptase反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為單鏈cDNA，熒光定量PCR采用Fast SYBR Green MasterMixSystem熒光定量PCR試劑盒，反應條件按照試劑盒說明書進行。β-actin作為管家基因。

1.2.5 Western blot 細胞轉染后48 h加入適量裂解液，變性后取50 μg總蛋白，經10%SDS-PAGE轉印至PVDF膜后，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入相應一抗，4℃孵育過夜，用PBS洗膜后加入相應二抗，室溫孵育1 h，加入ECL曝光。

1.2.6 CCK8實驗 將轉染后的細胞接種于96孔板，培養相應時間后，加入10 μL CCK8溶液，繼續培養4 h，450 nm處檢測吸光度。

1.2.7 克隆形成 細胞轉染24 h后制備成單細胞懸液，按每孔1000個細胞接種于6cm培養皿，每3d換1次培養液，培養3周后，用PBS漂洗，4%多聚甲醛固定30 min，結晶紫染色15 min后，在顯微鏡下計數，每50個細胞以上記為一個克隆。

1.2.8 流式細胞術 細胞轉染后48 h，收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次，加入100 μL染料結合緩沖液重懸后，分別加入10μLFITC-AnnexinV和5μL PI（50 mg/L）染料，室溫孵育15min，補加200μL結合緩沖液，靜置5min后經流式細胞儀檢測細胞凋亡率。1.3 統計學分析 采用SPSS 21.0統計軟件，實驗結果用均值±標準誤表示，結果采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE4在乳腺癌組織和癌旁正常組織的表達水平 采用RT-qPCR檢測了15例原發乳腺癌組織及配對的癌旁正常組織中HE4 mRNA的表達水平，結果顯示較配對的癌旁正常組織，在80%（12/15）的樣本中，原發乳腺癌組織HE4 mRNA表達上調（P< 0.001）（圖1）。

圖1 RT-qPCR檢測原發乳腺癌組織及配對的癌旁正常組織中HE4 mRNA表達水平Fig 1 Detecting the expression level of HE4 mRNA in primary breast cancer tissues and the paired adjacent normal tissue

2.2 HE4在乳腺癌細胞系及乳腺上皮細胞系中表達水平 通過定量PCR檢測正常乳腺細胞MCF10A和乳腺癌細胞系MCF7、MDA-MB-231和SKBR3中HE4 mRNA表達水平，結果顯示HE4在正常細胞中低表達，在乳腺癌細胞系中呈高表達（圖2A）。進一步通過Western blot檢測HE4蛋白表達水平，結果顯示HE4蛋白表達水平與mRNA結果一致，在MCF10A中低表達，MCF7、MDA-MB-231、SKBR3中高表達（圖2B）。證實HE4在乳腺癌中是潛在的促癌基因。

圖2 HE4在乳腺（癌）細胞系中表達水平Fig 2 The expression of HE4 in breast cancer cell line

2.3 siRNA對HE4表達水平的影響 細胞轉染HE4 siRNAs 24 h后提取細胞總RNA，RT-qPCR顯示實驗組HE4 mRNA表達水平較對照下降約80%（圖3A）。細胞轉染48 h后提取細胞總蛋白，Western blot顯示實驗組HE4蛋白表達水平較對照組顯著降低（圖3B）。提示HE4 siRNAs能有效抑制SKBR3細胞中HE4表達。

圖3 轉染HE4 siRNAs后SKBR3細胞HE4的表達水平Fig 3 The expression of HE4 in transfected SKBR3 cell with siRNAs

2.4 HE4表達對乳腺癌細胞增殖的影響 結果顯示，沉默HE4后細胞增殖能力顯著降低（圖4A）；沉默HE4表達的SKBR3細胞克隆個數顯著減少（圖4B）。提示沉默HE4表達能抑制乳腺癌細胞系SKBR3的細胞增殖能力。

圖4 沉默HE4表達對乳腺癌細胞SKBR3增殖能力的影響Fig 4 Effect of silencing HE4 on SKBR3 cell proliferation

2.5 HE4表達對乳腺癌細胞凋亡及相關信號通路的影響 結果顯示，沉默HE4表達的SKBR3細胞凋亡比例顯著上調（10%～15%vs 5%；圖5A）。沉默HE4表達后磷酸化的Erk和Akt表達下調（圖5B），提示沉默HE4表達可通過抑制Erk和Akt信號通路，而導致乳腺癌細胞凋亡。

圖5 沉默HE4表達對細胞凋亡及相關信號通路的影響Fig 5 Effect of silencing HE4 on cell apoptosis and signal pathway

3 討論

人附睪蛋白4由5個外顯子和4個內含子組成，并存在多種剪切方式[1]。目前關于HE4的生物學功能尚不清楚，其編碼的小分子分泌型蛋白與細胞外蛋白酶抑制劑具有高度同源性，其是由乳清酸性蛋白（WAP-type fourdisulphide core protein，WFDC）基因編碼的分泌型糖蛋白，但其是否同家族中的蛋白酶抑制因子一樣具有抑制蛋白水解酶作用，還有待于進一步研究[2]。

HE4表達水平與多種腫瘤形成具有一定相關性，Galgano等[3]報道HE4在多種惡性腫瘤組織中高表達，如子宮內膜癌、胃癌、支氣管肺（腺）癌、卵巢癌和乳腺癌等，且HE4表達水平與該腫瘤的發生發展存在相關性。通過RNA干擾技術沉默卵巢癌細胞中的HE4表達，結果顯示沉默HE4表達的卵巢癌細胞發生G1期阻滯，且細胞增殖、運動和侵襲能力顯著降低[4]。同時，外源表達HE4蛋白不僅能顯著增強子宮內膜癌和卵巢癌的體外細胞增殖、侵襲能力，還明顯促進了動物移植瘤的生長和轉移[5-6]。近期研究也表明沉默HE4表達能抑制胃癌的進展，且HE4表達水平與胃癌、小細胞肺癌患者預后相關[7-8]。Hellstrom等[9]比較了卵巢癌患者及正常人血清中HE4蛋白的含量，結果顯示多數卵巢癌患者血清中HE4蛋白高表達，但關于HE4在乳腺癌中的表達狀態及生物學作用還鮮有報道，本研究證實HE4在乳腺癌組織中高表達。進一步通過RNA干擾技術發現，沉默HE4表達的乳腺癌細胞SKBR3體外增殖能力顯著降低，凋亡能力顯著增強。因此，HE4蛋白的異常表達可能在多種腫瘤的演變過程中發揮著重要的作用。

然而，HE4參與腫瘤形成的具體信號通路目前仍不清楚，初步研究顯示可能與其激活NF-κB和EGFR-MAPK信號通路有關[10-11]。本研究證實，沉默HE4表達后，磷酸化的Erk和Akt水平顯著降低，而Erk和Akt在細胞增殖和凋亡中發揮著重要的作用[12]。提示HE4可能通過調控Erk和Akt參與乳腺癌的增殖和凋亡，其內在的分子機制尚需進一步闡明。

綜上，HE4作為一種新的腫瘤標志物正在引起越來越多研究者的關注，在腫瘤發生、發展和患者預后預測方面的作用在不斷被發現，但有關其在腫瘤中的作用機制還研究甚少，其與乳腺癌發生、發展和轉移的關系尚需進一步討論。

[1] Bingle L,Singleton V,Bingle C D.The putative ovarian tumour marker gene HE4 (WFDC2),is expressed in normal tissues and undergoes complex alternative splicing to yield multiple protein isoforms[J].Oncogene,2002,21(17)：2768

[2] Clauss A,Lilja H,Lundwall A.A locus on human chromosome 20 contains several genes expressing protease inhibitor domains with homology to whey acidic protein[J].Biochem J,2002,368(Pt 1)：233

[3]Galgano M T,Hampton G M,Frierson H F.Comprehensive analysis of HE4 expression in normal and malignant human tissues[J].Mod Pathol,2006,19(6)：847

[4]Zou S L,Chang X H,Ye X,et al.Effect of human epididymis protein 4 gene silencing on the malignant phenotype in ovarian cancer[J]. Chin Med J(Engl),2011,124(19)：3133

[5] Li J,Chen H,Mariani A,et al.HE4 (WFDC2)promotes tumor growth in endometrial cancer cell lines[J].Int J Mol Sci,2013,14(3)：6026

[6] Zhuang H,Tan M,Liu J,et al.Human epididymis protein 4 in association with Annexin II promotes invasion and metastasis of ovarian cancer cells[J].Mol Cancer,2014,13：243

[7] Guo Y D,Wang J H,Lu H,et al.The human epididymis protein 4 acts as a prognostic factor and promotes progression of gastric cancer [J].Tumour Biol,2015,36(4)：2457

[8] Wang X,Fan Y,Wang J,et al.Evaluating the expression and diagnostic value of human epididymis protein 4 (HE4)in small cell lung cancer[J].Tumour Biol,2014,35(7)：6847

[9] Hellstr?m I,Raycraft J,Hayden-Ledbetter M,et al.The HE4 (WFDC2)protein is a biomarker for ovarian carcinoma[J].Cancer Res,2003,63(13)：3695

[10]Clauss A,Ng V,Liu J,et al.Overexpression of elafin in ovarian carcinoma is driven by genomic gains and activation of the nuclear factor kappaB pathway and is associated with poor overall survival [J].Neoplasia,2010,12(2)：161

[11]Wang H,Zhu L,Gao J,et al.Promotive role of recombinant HE4 protein in proliferation and carboplatin resistance in ovarian cancer cells[J].Oncol Rep,2015,33(1)：403

[12]Mccubrey J A,Steelman L S,Chappell W H,et al.Ras/Raf/MEK/ ERK and PI3K/PTEN/Akt/mTOR cascade inhibitors：how mutations can result in therapy resistance and how to overcome resistance[J]. Oncotarget,2012,3(10)：1068

（2015-03-12收稿）

Action mechanism of human epididymis protein 4 in development and progression of breast cancer

ZHOU Yan1,SONG Wei-jie1,ZHANG Fei1,JI Wei1,TIAN Ran1,NIU Rui-fang1,LI Xiao-pei2
（1．Department of Public Laboratory,Cancer Institute and Hospital,Tianjin Medical University,National Clinical Research Center for Cancer，Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060,China;2.Basic Medical College,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China）

Objective：To explore the mechanism of human epididymis protein 4（HE4）in development and progression of breast cancer.Methods：Reverse transcription quantitative PCR（RT-qPCR）was used to detect the HE4 mRNA expression levels in primary breast cancer tissues and the paired adjacent normal tissues.The HE4 mRNA and protein expression was also detected in breast epithelial cell lines by RT-qPCR and western blot,respectively.The RNAi was used to knock down the HE4 expression in HE4 high expression level cell line SKBR3,CCK8 and colony formation assays were performed to analyze the proliferation ability.Flow cytometry was applied to detect the apoptotic cells in HE4-depleted cells.The phosphorylation expression levels of Erk and Akt was evaluated by western blot.Results：The HE4 mRNA was up-regulated in primary breast cancer tissues compared with the adjacent normal breast tissues.Depletion of HE4 expression suppressed the proliferation and promoted the apoptosis in SKBR3 breast cancer cell line.Furthermore,the phosphorylation expression levels of Erk and Akt were reduced in HE4-depleted SKBR3 cells.Conclusion：HE4 promotes breast cancer development and progression through Erk and Akt signaling.

human epididymis protein 4;breast cancer；proliferation;apoptosis

R737.9

A

1006－8147（2015）06-0466-03

天津市應用基礎及前沿技術研究計劃項目基金資助（10JCYBJC14400）

周巖（1985-），女，碩士在讀，研究方向：生物醫學工程；通信作者：黎小沛，E-mail：xpli@tijmu.edu.cn。