沉默Notch4基因對乳腺癌細胞系MDA-MB-231增殖和遷移侵襲能力的影響

任宗娜

（天津醫科大學腫瘤醫院腫瘤研究所，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津300060）

論著

沉默Notch4基因對乳腺癌細胞系MDA-MB-231增殖和遷移侵襲能力的影響

任宗娜

（天津醫科大學腫瘤醫院腫瘤研究所，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津300060）

目的：探討Notch4基因對乳腺癌細胞系MDA-MB-231增殖、遷移侵襲能力的影響。方法：脂質體法用Notch4 siRNA轉染乳腺癌細胞系MDA-MB-231，RT-PCR和Western blot檢測Notch4基因的表達，通過MTT實驗評價MDA-MB-231細胞增殖活性的改變；流式細胞術檢測細胞周期，通過Transwell實驗評價腫瘤細胞遷移和侵襲能力的改變；RT-PCR方法檢測Notch信號通路相關基因的變化。結果：Notch4 siRNA有效地轉入細胞并抑制了Notch4基因的表達。轉染Notch4 siRNA細胞的增殖活性及體外遷移侵襲能力均顯著下降（P<0.05）。細胞周期阻滯在G0/G1，Hes1、Hey1、c-Myc、cyclinD1、MMP9 mRNA水平明顯低于對照組（P<0.05）。結論：Notch4 siRNA可明顯抑制乳腺癌細胞系MDA-MB-231增殖、遷移和侵襲能力。Notch4基因可做為三陰性乳腺癌基因治療的靶基因。

Notch4基因；乳腺癌；RNA干擾；增殖；遷移；侵襲

三陰乳腺癌（triple-negativebreastcancer，TNBC）是以雌激素受體α（estrogen receptorα，ERα）、孕酮受體2（progesterone receptor 2，PR）和人表皮生長因子受體（human epidermal growth factor receptor，HER-2）均不表達為特點的乳腺癌細胞[1]，占所有乳腺癌細胞的10%～15%[2-4]，由于缺乏針對這些受體的有效治療靶點，無法采用內分泌治療和曲妥單抗治療，導致預后較差[5]。化療存在療效不穩定、副作用大以及多藥耐藥等問題，因此，急需找到針對TNBC的有效的分子治療靶點。Notch信號通路廣泛存在于脊椎動物和非脊椎動物，在進化上高度保守，通過相鄰細胞之間的相互作用調控胚胎發育、血管發生、程序性細胞死亡和細胞增殖等多種生理過程[6-9]，在腫瘤的侵襲、轉移、凋亡、增殖和血管生成等病理過程中也發揮著關鍵作用[10-11]。目前在脊椎動物中共發現 4個同源體 Notch1、Notch2、Notch3、Notch4[12]。Speiser等[13]研究發現Notch4是三陰性乳腺癌的一個生物學標志物。本研究利用RNAi技術沉默乳腺癌細胞系MDA-MB-231的Notch4基因，觀察其對乳腺癌細胞系MDA-MB-231的增殖、遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 乳腺癌細胞系MDA-MB-231具有間質特性和高轉移能力，來源于美國標準生物品收藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。MDA-MB-231細胞培養于含10%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS；GIBCO公司，美國）的RPMI-1640培養基（GIBCO公司，美國）中。將對數生長期細胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，用于體外和體內實驗。

1.2 siRNA細胞轉染 采用Lipofectamine 2000脂質體轉染，方法按照說明書。接種1×105個細胞/孔于6孔板，以含血清無抗生素的培養基培養，細胞為30%～50%飽和度時用于轉染(表1)。將5 μL（100 pmol）的stealth RNAi加入含有250 μL的Opti-MEM（GIBCO公司，美國）的EP管中，輕輕混勻；將5 μL的 Lipofectamine 2000加入含有 250 μL的Opti-MEM的EP管中，輕輕混勻；室溫靜置孵育5 min；將上述液體混合，室溫靜置孵育20 min；將上述混合液緩慢滴入含有1.5 mL OPTI-DMEM無血清培養基的細胞中，4～6 h后換成含10%FBS的培養液。轉染48 h后裂解細胞提取總RNA及免疫熒光檢測。實驗分組：實驗組（Notch4 siRNA組）；陰性對照組（NC siRNA組）；空白對照組（Mock siRNA組）。

表1 siRNA干擾序列Tab 1 The sequences of siRNA oligonucleotides

1.3 MTT 細胞胰酶消化對數期細胞，終止后離心收集，制成細胞懸液。細胞懸液接種于96孔板，細胞計數調整其濃度至3 000個細胞/孔，邊緣孔用無菌PBS填充，5%CO2，37℃孵育。設置6個復孔，分別處理1、2、3、4 d后，每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL，即0.5%MTT），繼續培養4 h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用PBS沖2～3遍后，再加入含MTT的培養液。終止培養，小心吸去孔內培養液。每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570nm處測量各孔的吸光值。

1.4 QTR-PCR 提取細胞總RNA，cDNA的合成，QPCR反應。每個樣本中每個基因的檢測均重復3次。CT值為熒光信號達到設定閾值時所經過的循環數，ΔCT值為各樣本中目的基因的CT值與管家基因GAPDH的CT值之差，2-△Ct則為該樣本中目的基因相對于GAPDH mRNA的表達量。管家基因GAPDH和目的基因的引物序列均采用Oligo6.0軟件設計，引物及探針均由上海生工生物工程公司合成（表2）。

表2 引物序列Tab 2 Primer sequence

1.5 流式細胞儀檢測細胞周期 收集轉染后72 h各組細胞，乙醇固定過夜，RNA酶水浴加熱消化后加入碘化丙啶（PI，50 μg/mL），4℃放置15 min后流式細胞儀檢測。

1.6 細胞侵襲和遷移實驗 將懸浮于500 μL無血清培養基的5×104個231-siNotch4、231-siControl細胞接種于含Metrigel和不含Metrigel的transwell上室，下層加入750 μL含10%FBS的細胞培養液，培養8 h。取出transwell小室，用棉簽拭去上層未穿過的細胞，通過3步染色試劑盒（Thermo Scientific公司，美國）固定、染色，自來水漂洗3次，室溫風干，中性樹膠固定，于鏡下觀察穿孔細胞數目，隨機選取5個視野計數并取其平均值。

1.7 Western blot檢測 使用細胞裂解液裂解細胞，提取總蛋白，在10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳。將蛋白膜轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后，加入鼠一抗Notch4（1∶1 000），4℃轉動過夜。第2天取出膜，TBST漂洗后，加入羊抗鼠二抗反應，室溫孵育1 h，TBST漂洗。化學發光法（ECL）顯影，暗室曝光。

1.8 統計學方法 體外細胞學實驗均設每組3個復孔細胞，實驗數據用±s表示，多組間均數比較采用單因素方差進行分析，P＜0.05為差異有統計學意義。統計學分析采用SPSS 13.0軟件進行處理。

2 結果

2.1 倒置熒光顯微鏡下觀察實驗細胞 絕大多數細胞都熒光著色，與背景反差明顯，熒光著色細胞有明顯的細胞輪廓（圖1）。

圖1 轉染48 h后倒置熒光顯微鏡下觀察轉染后實驗細胞（x100）Fig 1 MDA-MB-231 cells under fluoroscope at 48 h after transfection(x100)

2.2 RT-PCR和Westernblot檢測Notch4的表達 腫瘤細胞體外運動能力的變化RT-PCR和Western blot結果顯示，與陰性對照組和空白對照組相比，實驗組Notch4的表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖2）。

圖2 Notch4 siRNA對乳腺癌細胞系MDA-MB-231 Notch4 mRNA和蛋白水平表達的影響（*P＜0.05）Fig 2 Effect of siRNA on Notch4 mRNA and protein expression in MDA-MB-231 cells（*P＜0.05）

2.3 MTT法檢測各組細胞的增殖活性 轉染Notch4 siRNA后第1、2天，各實驗組增殖活性無明顯差異，48 h的OD值，Notch4 siRNA組：0.48±0.07，NC siRNA組：0.51±0.12，Mock siRNA組：0.54±0.17，無明顯統計差異（P＞0.05）。Notch4 siRNA組較其他兩組在第3～5天出現差異，第4天差異最明顯，此時Notch4 siRNA組OD值：0.93±0.08，NC siRNA組OD值：1.26±0.29，Mock siRNA組OD值：1.3±0.08，比較有統計學差異（P＜0.05）。以時間為橫軸、OD值為縱軸繪制生長曲線（圖3）。

圖3 轉染Notch4 siRNA對乳腺癌細胞系MDA-MB-231增殖的影響Fig 3 The growth curve by the MTT assay in different groups of MDA-MB-231 after transfection with Notch4 siRNA

2.4 流式檢測細胞周期變化 由于細胞的增殖與細胞周期密切相關，在觀察到siRNA介導的Notoh4下調能夠抑制MDA-MB-231細胞的增殖后，利用流式細胞儀檢測了MDA-MB-231細胞在轉染siRNA 72 h后的細胞周期分布。結果MDA-MB-231細胞在轉染后其典型細胞周期分布為G1：52.3%，G2：17.8%，S：30%；而對照組細胞的周期分布為Gl：71.8%，G2：15.8%，S：12.4%；呈G0/G1阻滯（圖4）。

圖4 Notch4沉默后對乳腺癌細胞系MDA-MB-231細胞周期的影響Fig 4 The effect of Notch4 siRNA on cell cycle progression ofMDA-MB-231 cells

2.5 沉默Notch4基因對乳腺癌細胞系MDA-MB-231體外遷移侵襲能力的影響 增殖抑制實驗表明，Notch4基因沉默后第3天開始出現差異。因此，為了減少細胞增殖對遷移侵襲實驗的影響，檢測遷移侵襲能力的實驗選定在轉染后24～48 h進行。結果顯示Notch4 siRNA組與其余兩組相比，細胞的遷移、侵襲能力顯著下調，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖5）。

2.6 RT-PCR檢測基因表達 RT-PCR檢測轉染72 h后，Notch4 siRNA組、NC siRNA組、Mock siRNA組的不同基因的表達。結果顯示Hes1、Hey1、c-Myc、cyclinD1 mRNA表達均明顯低于其他兩組（P＜0.05）（圖6）。

圖5 Notch4沉默后對乳腺癌細胞系MDA-MB-231體外運動能力的影響（*P＜0.05）Fig 5 The effect of Notch4 siRNA on migration and invasion activity of MDA-MB-231 cells in vitro（*P＜0.05）

圖6 轉染后MDA-MB-231細胞的Hes1、Hey1、c-Myc、cyclinD1、MMP9 mRNA表達的差異（*P＜0.05）Fig 6 The expression of Hes1,Hey1,c-Myc,cyclinD1 and MMP9 in MDA-MB-231 cells after transfection（*P＜0.05）

3 討論

Naik等[14]研究發現，Notch4異常高表達與乳腺癌的發生和發展密切相關，而且在Basal乳腺癌細胞中高表達。在高表達Notch4的乳腺癌細胞中，Notch4增加細胞的抗凋亡能力，提高對化療藥的耐受性[14]。研究發現，活化的Notch4還可以使正常乳腺上皮細胞在體外發生惡性轉化[15]。Lombardo等[16]研究發現，MCF-7細胞高表達Notch4受體，使細胞發生上皮間質轉化，增加對內分泌治療的不敏感性。臨床資料顯示[17]，Notch4高表達的腫瘤患者，其總體生存較短。所以，Notch4基因高表達是乳腺癌患者的不良預后因素。

在細胞周期檢測中，沉默Notch4基因后細胞發生了G0/G1阻滯，提示Notch4蛋白是通過促進細胞周期誘導細胞增殖。細胞周期素D1（cyclinD1）屬細胞周期素家族成員，可與CDK4結合并激活其活性，調控細胞由G1期至S期的轉變。本實驗證實抑制Notch4基因的表達能下調cyclinD1，進而阻止人乳腺癌MDAMB-231細胞從G1期進入S期，所以靶向Notch4的藥物能緩解乳腺癌細胞的增殖速率。原癌基因c-Myc是決定細胞從G0/G1期進入S期的“開關”，而且在G2/M細胞周期進展中也起著重要作用，與細胞增殖關系密切[18-20]。使用RNA干擾技術沉默c-Myc基因能有效抑制腎癌細胞增殖[21]。張巧琳等[22]發現c-Myc抑制劑能抑制腎癌細胞786-0的增殖并發生G0/G1期細胞周期阻滯。以上研究說明c-Myc基因與細胞的增殖和周期密切相關，同樣，我們發現抑制Notch信號通路后乳腺癌細胞增殖受到抑制，而且停留在G0/G1期的細胞比例明顯升高。c-Myc與Notch4信號通路在生物學行為上具有相似性，兩者可能存在協同性。在本實驗中，我們采用小干擾沉默乳腺癌細胞株MDA-MB-231的Notch4蛋白后c-Myc的mRNA水平下調，說明在乳腺癌中c-Myc可能也作為Notch4蛋白的靶基因而發揮作用。本研究發現，在沉默Notch4基因后Hes1和Hey1 mRNA表達水平均明顯降低。Notch信號傳導是通過信號發出細胞的配體結合信號接收細胞的受體由γ-內分泌酶切除受體胞內段使其激活。胞內段入核后與轉錄因子CSL形成復合體，調節下游靶基因的表達，可見，Notch信號主要功能取決于下游靶基因的功能。下游靶基因主要是Hes/ Hey家族，轉錄后主要參與細胞增殖、分化、凋亡等從而決定細胞命運。MMP9是基質金屬蛋白酶家族中的成員之一，主要作用就是降解基質中的蛋白，與乳腺癌的侵襲性、轉移密切相關[23]。本實驗發現，在沉默Notch4基因后MMP9的mRNA表達水平均明顯降低，提示在MDA-MB-231細胞中Notch4基因可能通過下調MMP9的水平，抑制細胞的遷移、侵襲能力。

綜上所述，本實驗證實了通過沉默Notch4的表達可明顯抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖、遷移、侵襲能力，結合Notch4在增強乳腺癌細胞干性、抗凋亡和耐藥性等方面的作用，我們認為靶向Notch4的治療是可行的，將有可能為三陰性乳腺癌基因治療的一種新選擇。

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（2015-05-06收稿）

Inhibition effect of silencing Notch4 gene on the proliferation and migration and invasion activity of breast cancer cell line MDA-MB-231

REN Zong-na
（Cancer Institute and Hospital，Tianjin Medical University，National Clinical Research Center of Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Tianjin 300060，China）

Objective：To investigate the effect of Notch4 gene on the proliferation and migration and invasion activity of breast cancer cells.Methods：Lipofectin Reagent was used to transfect Notch4 siRNA into breast cancer cell MDA-MB-231.The mRNA and protein expression level of Notch4 were detected by RT-PCR and Western blot.Cell grow curve was measured by MTT assay.Matrigel-coated Transwell and Transwell inserts were applied to examine cell migration and invasion activity in vitro.The cell cycle distribution was assessed by flow cytomentry.The expression levels of Hes1,Hey1,c-Myc,cyclinD1 and MMP9 were detected by RT-PCR.Results：The Notch4 siRNA was effectively transfected into MDA-MB-231 cells.The mRNA and protein expression level of Notch4 were inhibited.MTT test showed that the proliferation of transfected cells was significantly lower than those of the other two groups(P<0.05).Transwell chamber testshowed thatthe migration and invasion capability of transfected cells was significantly lower than control(P<0.05).Cell cycle of Notch4 siRNA transfected group cells was arrested in G0/G1 phase.The expression levels of Hes1,Hey1,c-Myc,cyclinD1 and MMP9 between Notch4 siRNA transfected group and other two groups were statistically different(P<0.05).Conclusion：Notch4 gene by Notch4 siRNA can remarkably inhibitproliferation and migration and invasion activity of cell lines of MDA-MB-231.Notch4 gene may be used as the target for triple-negative breastcancer gene therapy.

Notch4 gene；breast cancer；RNAi;proliferation；migration；invasion

R737.9

A

1006－8147（2015）06-0469-05

任宗娜（1989-），女，碩士在讀，研究方向：生物化學與分子生物學；E-mail：zongnaren@163.com。