利用改良的CRISPR/Cas9基因編輯系統構建HeLa細胞SND1基因敲除穩定株

劉郁瑩，崔曉騰，高星杰，趙秀娟，付雪，葛林，蘇超，楊潔,

（天津醫科大學1.生物化學系；2.基礎醫學研究中心；3.細胞生物學系，天津 300070）

論著

利用改良的CRISPR/Cas9基因編輯系統構建HeLa細胞SND1基因敲除穩定株

劉郁瑩1，崔曉騰1，高星杰2，趙秀娟3，付雪1，葛林1，蘇超2，楊潔1,2

（天津醫科大學1.生物化學系；2.基礎醫學研究中心；3.細胞生物學系，天津 300070）

目的：利用改良的CRISPR/Cas9基因編輯系統敲除HeLa細胞中SND1基因，構建HeLa細胞SND1基因敲除穩定株。方法：設計一對特異性識別SND1基因第二個啟動子的上下游sgRNA，以PX462質粒為載體，構建出一對重組真核表達質粒。酶切和測序鑒定后，將一對重組質粒共同轉染進入HeLa細胞中，使用嘌呤霉素進行陽性細胞篩選，挑取單克隆細胞進行培養。最后用Western Blot鑒定敲除效果。結果：sgRNA正確插入到PX462質粒載體中，轉染并篩選單克隆后的細胞中沒有SND1蛋白的表達。結論：成功構建出HeLa細胞SND1基因敲除穩定株。

SND1；基因敲除；CRISPR/Cas9；HeLa細胞

人類SND1（Staphylococcal Nuclease Domain-Containing Protein 1）蛋白是在不同種屬間具有高度保守性的蛋白質[1-4]，廣泛參與細胞多種生物學過程[5-8]。本實驗是利用改良的CRISPR/Cas9基因編輯系統，即以一對單鏈向導RNA（single guide-RNA, sgRNA）靶標SND1基因，招募Cas9核酸酶的突變體Cas9n核酸切口酶（Cas9 D10 nickase,Cas9n）對其進行切割，從而敲除SND1基因，構建出HeLa細胞SND1基因敲除穩定株，為更加深入地研究SND1蛋白的功能提供了一個SND1基因敲除的人類細胞模型。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 HeLa細胞為本實驗室留存；真核表達質粒pSpCas9n（BB）-2A-Puro（PX462）由天津醫科大學吳旭東教授惠贈；trans1-T1感受態細胞、Trans2K PlusII DNA marker購自北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶BbsI、DMEM高糖培養基購自Thermo公司；T4連接酶購自NEB公司；質粒保護的核酸外切酶（plasmid safe exonuclease）購自Epicentre公司；去內毒素質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自Biomiga公司；Neofect轉染試劑購自零客創智生物科技有限公司；BCA蛋白測定試劑盒購自Pierce公司；鼠源SND1蛋白抗體為本實驗室自制[9]；β-tubulin蛋白抗體購自Sigma公司；辣根過氧化物酶標記的抗鼠源IgG二抗購自Fermentas公司；LumiGLo化學發光底物購于KPL公司；RIPA裂解液、嘌呤霉素（puromycin）購自北京索萊寶科技有限公司。CO2培養箱購自Thermo公司；Western blot電泳槽、電泳儀購自Bio-Rad公司。sgRNA序列合成由蘇州金唯智生物科技有限公司完成；質粒測序由北京天一輝遠生物科技有限公司完成。

1.2 實驗方法

1.2.1 針對SND1基因序列的sgRNA設計 （1）采用http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/網站確定人類SND1（NM_014390.2）的基因序列。（2）根據文獻提示[10]，使用 http：//crispr.mit.edu/設計 SND1基因 double nick的上下游sgRNA。sgRNA設計原則：（1）sgRNA的5′端第一個堿基若不是G，則需要在前面加上1個G；（2）以sgRNA序列為模版，設計出其互補鏈；（3）sgRNA及其互補鏈分別添加BbsI的酶切位點。

1.2.2 重組真核表達質粒PX462-sgRNA的構建 （1）PX462載體線性化：使用快速限制性內切酶BbsI線性化PX462質粒載體，切膠回收。體系：1 μg PX462載體，1 μL BbsI，1 μL FastAP，2 μL 10×Green FastDigest Buffer，加水稀釋至20 μL。程序：37℃，30 min；4℃，stop。（2）sgRNA的合成及形成二聚體：人工合成sgRNA寡核苷酸鏈A、B及其互補鏈，使用降落PCR退火形成二聚體。體系：100 nmol sgRNA-A/B，100 nmol sgRNA-A/B的互補鏈，1 μL 10×T4 Ligation Buffer，0.5 μL T4 PNK，加水至10 μL。程序：37℃，30 min；95℃，5 min；-1℃/min，至25℃；4℃，stop。（3）sgRNA二聚體與PX462線性載體連接：PX462載體和降落PCR產物比例為1∶3，室溫（25℃）反應60min。體系：PX462線性載體50ng，降落PCR產物150 ng，1 μL 10×T4 Ligation Buffer，加水稀釋至10 μL，1 μL T4 Ligase。程序：25℃，60 min；4℃，stop。（4）重組質粒純化：使用質粒保護的核酸外切酶去除非特異連接。體系：11μL二聚體與載體連接后的產物，1.5 μL 10×PlasmidSafe Buffer，1.5 μL 10mmolATP,1μLPlasmidSafeexonuclease。程序：37℃，30 min；4℃，stop。（5）轉化trans1-T1感受態細胞，挑取單克隆搖菌，使用去內毒素質粒小提試劑盒提取質粒，進行酶切和測序驗證。

1.2.3 重組真核表達質粒的酶切鑒定 使用快速限制性內切酶BbsI對PX462質粒載體、PX462-sgRNA-A、PX462-sgRNA-B進行酶切。體系：1 μg質 粒 ，1 μL BbsI，1μL FastAP，2 μL 10×Green FastDigest Buffer，加水稀釋至20 μL。程序：37℃，30 min；4℃，stop。酶切后，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳對酶切產物進行鑒定。

1.2.4 HeLa細胞培養及轉染 以去內毒素質粒提取試劑盒提取無內毒素質粒載體PX462和重組真核表達質粒PX462-sgRNA-A、PX462-sgRNA-B。 HeLa細胞接種至6 cm皿中，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，置于37℃、5%的CO2培養箱中培養,至細胞50%～60%匯合時，根據產品說明書使用Neofect轉染試劑瞬時轉染質粒載體PX462（HeLa-SND1-WT）或共轉重組真核表達質粒PX462-sgRNA-A和 PX462-sgRNA-B（HeLa-SND1-KO）。

1.2.5 HeLa細胞SND1基因敲除穩定株的單克隆篩選 轉染后48 h，更換培基為含有2 μg/mL Purom ycin和10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，以未轉染的HeLa細胞為陰性對照。加藥48 h后，未轉染的HeLa細胞全部被殺死。72 h后撤去培基中的Puromycin繼續培養。待細胞長滿，將細胞用胰酶消化，鋪到10 cm皿中，平均每個顯微鏡低倍鏡視野中有3～5個細胞即可。待細胞長成單克隆集落，用槍頭分別將單克隆集落輕輕刮取，移至96孔板中培養。待96孔板長滿，移至24孔板中繼續培養。1.2.6 HeLa細胞SND1基因敲除穩定株Western Blot檢測 將篩選后的單克隆穩定株HeLa-SND1-WT和HeLa-SND1-KO分別傳至6 cm皿中培養。待細胞長滿，使用預冷的PBS緩沖液對細胞洗滌3次，吸凈PBS后，加入300μL RIPA裂解液，用干凈的細胞刮刮取細胞至1.5 mL離心管中，冰上靜置裂解15 min。之后對其進行超聲處理，強度60%，時間30 s（1次10 s，間隔5 s，共進行3次）。4℃13 000 r/min超速離心10 min，取上清細胞裂解液。用BCA蛋白測定試劑盒測定裂解液的蛋白濃度后，加入5×上樣緩沖液（50%甘油，10%SDS，0.5%溴酚藍，250 mmol pH6.8 Tris-HCl），99℃對其熱變性10 min。進行8% SDS-PAGE電泳后，用濕電轉膜儀將PAGE膠上蛋白質轉移到0.45 μm PVDF上。使用含有5%脫脂牛奶的TBST溶液封閉2 h后，用自制鼠源SND1抗體4℃孵育過夜。使用TBST溶液洗滌PVDF膜3次，每次10 min。用辣根過氧化物酶標記的抗鼠源IgG二抗室溫孵育2 h。之后再用TBST溶液洗滌PVDF膜3次，每次10 min。孵育LumiGLo化學發光底物1 min，進入暗室曝光。

2 結果

2.1 sgRNA靶點的選擇及寡核苷酸鏈的設計 由于SND1基因第1個外顯子區（expressed region 1, EXON 1）和基因編碼區（Coding Sequence,CDS）的重疊區域過短，因此選取第2個外顯子區進行sgRNA設計。CRISPR/Cas9系統工作示意圖如圖1。設計好的sgRNA及其互補鏈如表1。

圖1 CRISPR/Cas9系統切割SND1基因外顯子上下游Fig 1 CRISPR/Cas9 system cut the upstream and downstream of SND1

表1 上下游sgRNA及其互補鏈寡核苷酸序列Tab 1 The nucleotide sequences of the upstream and downstreamsgRNA

2.2 重組真核表達質粒PX462-sgRNA的酶切和測序結果 利用BbsI限制性內切酶對構建好的PX462-sgRNA-A和PX462-sgRNA-B進行酶切。結果如圖2 A，成功構建的質粒不含有BbsI酶切位點，因此不能被切割為線性。測序結果如圖2 B，插入序列的位置、方向均正確，質粒構建成功。

圖2 重組真核表達質粒的酶切和測序結果Fig 2 The enzyme digestion and sequencing of recombinant eukaryotic expressional plasmid

2.3 Western blot檢測HeLa細胞SND1基因敲除穩定株中SND1蛋白的表達 結果如圖3，同HeLa-SND1-WT相比，HeLa-SND1-KO中的SND1沒有表達，HeLa細胞SND1基因敲除穩定株構建成功。

圖3 單克隆穩定株Western blotFig 3 Western blotting of monoclonal stable strain

3 討論

SND1蛋白序列在不同生物中具有高度的保守性，參與調控細胞多種重要的生理過程。有研究表明，SND1蛋白在腫瘤遷移中也有作用[11]。因此，建立穩定敲除SND1蛋白的細胞株有助于研究其生理病理條件下的功能。

本實驗中，我們利用CRISPR/Cas9系統來完成對HeLa細胞中SND1基因的靶向性敲除。CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences,CRISPR）序列本是細菌抵御病毒入侵的防御機制，近年來科學家對其進行改造，成為基因編輯的又一有力武器。傳統CRISPR/Cas9系統是以sgRNA為向導，靶標目的基因，招募Cas9核酸酶對DNA雙鏈進行切割，從而敲除該基因[12]。對比 ZFN（Zinc-finger nucleases） 技術和 TALEN（transcription activator-like effector nucleases）技術，此方法簡便易行，成為靶向基因編輯的重要技術。但是由于sgRNA長度的局限，傳統CRISPR/Cas9系統容易產生脫靶效應，即sgRNA識別到其他基因處，導致其他基因敲除。麻省理工學院的Zhang等[13]對其進行改良，將Cas9核酸酶的RuvC結構域中的天冬氨酸突變成丙氨酸（D10A），導致RuvC結構域失去活性，突變后的Cas9酶變成Cas9n核酸切口酶，只能切割單鏈。如果DNA只被一個Cas9n切割，產生單鏈缺口，細胞很快利用堿基切除修復途徑進行DNA修復。因此使用一對sgRNA對目的基因上下游進行靶標并招募Cas9n進行切割，導致細胞利用非同源性末端接合（non-homologous end joining,NHEJ）機制進行DNA修復。此修復機制并不精確，易產生框移突變，從而達到敲除目的基因的作用。

實驗中，我們選擇PX462質粒作為載體，該質粒可以同時表達Cas9n和插入的sgRNA，簡化了表達Cas9n質粒和sgRNA質粒共轉染的步驟。轉染后，使用2 μg/mL Puromycin進行陽性細胞篩選。同時使用未轉染的HeLa細胞作為對照，也加入2 μg/mL Puromycin，待該細胞全部殺死時，即認為轉染組存活下來的細胞為帶有Puromycin抗性的陽性細胞。之后撤掉藥物，使用完全培基對其進行培養和單克隆篩選。最后，使用WesternBlot對單克隆細胞進行鑒定，從而獲得HeLa細胞SND1基因敲除穩定株。

[1] Saarikettu J,Ovod V,Vuoksio M,et al.Monoclonal antibodies against human Tudor-SN[J].Hybridoma(Larchmt),2010,29(3)：231

[2] Rodríguez L,Ochoa B,Martínez M J.NF-Y and Sp1 are involved in transcriptional regulation of rat SND p102 gene[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,356(1)：226

[3]Broadhurst M K,Lee R S,Hawkins S,et al.The p100 EBNA-2 coactivator：a highly conserved protein found in a range of exocrine and endocrine cells and tissues in cattle[J].Biochim Biophys Acta, 2005,1681(2/3)：126

[4] Zhao C T,Shi K H,Su Y,et al.Two variants of zebrafish p100 are expressed during embryogenesis and regulated by Nodal signaling [J].FEBS Lett,2003,543(1/3)：190

[5] Liu X,Dong L,Zhang X,et al.Identification of p100 target promoters by chromatin immunoprecipitation-guided ligation and selection(ChIP-GLAS)[J].Cell Mol Immunol,2011,8(1)：88

[6] Gao X,Zhao X,Zhu Y,et al.Tudor staphylococcal nuclease(Tudor-SN)participates in small ribonucleoprotein (snRNP)assembly via interacting with symmetrically dimethylated Sm proteins[J].J Biol Chem,2012,287(22)：18130

[7] Su C,Zhang C,Tecle A,et al.Tudor staphylococcal nuclease (Tudor-SN),a novel regulator facilitating G1/S phase transition, acting as a co-activator of E2F-1 in cell cycle regulation[J].J Biol Chem,2015,290(11)：7208

[8] Gao X,Fu X,Song J,et al.Poly(a)(+)mRNA-binding protein Tudor-SN regulates stress granules aggregation dynamics[J].FEBS J,2015,282(5)：874

[9] Saarikettu J,Ovod V,Vuoksio M,et al.Monoclonal antibodies against human Tudor-SN[J].Hybridoma(Larchmt),2010,29(3)：231

[10]Ran F A,Hsu P D,Wright J,et al.Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system[J].Nat Protoc,2013,8(11)：2281

[11]Yu L,Liu X,Cui K,et al.SND1 Acts downstream of TGFβ1 and upstream of smurf1 to promote breast Cancer metastasis[J].Cancer Res,2015,75(7)：1275

[12]Gilbert L A,Larson M H,Morsut L,et al.CRISPR-Mediated modular RNA-Guided regulation of transcription in eukaryotes[J]. Cell,2013,154(2)：442

[13]Ran F A,Hsu P D,Lin C Y,et al.Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity[J].Cell,2013, 154(6)：1380

（2015-04-13收稿）

Construction of HeLa SND1 knockout gene stable strain by using modified CRISPR/Cas9 gene editing system

LIU Yu-ying1,CUI Xiao-teng1,GAO Xing-jie2,ZHAO Xiu-juan3,FU Xue1,GE Lin1,SU Chao2,YANG Jie1.2
（Tianjin Medical University 1.Department of Biochemistry;2.Research Center of Basic Medical Science;3.Department of Cell Biology, Tianjin 300070,China）

Objective：To apply modified CRISPR/Cas9 gene editing system to knock out the SND1 gene in HeLa cell and construct HeLa SND1 gene knockout stable strain.Methods：A pair of sgRNAs that could specially identify the upstream and downstream of SND1 gene second promoter were designed,then a recombinant eukaryotic expressional plasmid by the carrier of PX462 was constructed.After enzyme digestion and sequencing,a pair of recombinant plasmids into HeLa cell were co-transfected,then puromycin was used to screen positive cell and the monoclonal cell was developed.The knockout effect was measured by western blotting.Results：sgRNA was correctly inserted into the PX462 recombinant plasmid,and SND1 protein was undetected in HeLa cell after transfection and screening of monoclonal cell.Conclusion：HeLa SND1 gene knockout stable strain can be successfully built.

SND1;gene knockout;CRISPR/Cas9;HeLa cells

Q7

A

1006－8147（2015）06-0480-04

劉郁瑩（1986-），女，碩士在讀，研究方向：腫瘤免疫；通信作者：楊潔，E-mail：yangji@tmu.edu.cn。