血漿miRNA-372/373在正常獻血者和HBV早期感染獻血者中的表達差異

安蓬蓬，湯 華，郭軍飛

（1.天津市血液中心質管科，天津300110；2.天津醫科大學天津市生命科學中心實驗室，天津300070）

論著

血漿miRNA-372/373在正常獻血者和HBV早期感染獻血者中的表達差異

安蓬蓬1，湯 華2，郭軍飛2

（1.天津市血液中心質管科，天津300110；2.天津醫科大學天津市生命科學中心實驗室，天津300070）

目的：研究miRNA-372/373與HBV早期感染的相關性，分析其在HBV早期感染診斷中的潛在應用價值。方法：收集來源于2013年3月至9月天津市內無償獻血者所獻血液的血漿標本留樣，共54份，分為正常組、酶免單陽組（E單陽組）和酶免核酸雙陽組（EN雙陽組）。提取此3組共54份血漿標本中的miRNA－372和miRNA－373，用實時熒光定量PCR方法進行檢測。分別比較miRNA－372和miRNA－373在3組血漿標本之間的表達差異，并對各組間的miRNA表達趨勢進行統計學分析；同時，對miRNA－372、miRNA－373的相對表達水平分別與核酸檢測HBV核酸陽性血漿標本中的HBV DNA拷貝數進行相關性分析。結果：經實時熒光定量PCR檢測，與正常獻血者相比，miRNA－372、miRNA－373在E單陽組和EN雙陽組中均表達上調，其中，miRNA－372、miRNA－373在EN雙陽組中表達上調更為顯著。進一步分析發現，在EN雙陽組中，miRNA－372、miRNA－373均與相應的HBV DNA拷貝數呈正相關性，且與miRNA－372相比，miRNA－373與相應的HBV DNA拷貝數的正相關性更為明顯。結論：miRNA－372、miRNA－373與HBV早期感染密切相關，提示miRNA－372、miRNA－373在HBV感染的早期診斷中具有潛在價值。

微小RNA；miRNA-372；miRNA-373；HBV早期感染

在我國，乙肝病毒是威脅血液安全的主要因素。目前，采供血機構多同時采用ELISA檢測和核酸檢測（NAT）兩種方法對血液進行HBV檢測。雖然NAT檢測大大縮短了HBV的檢測“窗口期”，很大程度上降低了經血傳播疾病發生的風險，但NAT檢測的準確性還是會受到病毒含量、病毒變異等因素的影響。1993年，Lee等[1]發現了第一個miRNA（lin-4），它是一類長度在21～25 nt的內源性非編碼單鏈小分子RNA。2008年，Lawrie首次在人類血清中發現miRNA，由于miRNA可以廣泛而穩定地存在于人類細胞外液，一直以來，科學家都致力于其在非侵襲性臨床疾病診斷中的應用。miRNA-373與miRNA-371a、miRNA-371b及miRNA-372同屬于miRNA-371-373簇[2]，它們源自相同的初級miRNA的轉錄[3]，對HBV感染來說，有研究表明miRNA-372/373可以增加HBV蛋白及核心DNA的表達[4]。目前相關研究都是集中在細胞、組織中的miRNA-372/373上，關于循環中、血漿中miRNA-372/373的研究甚少，本研究通過檢測HBV感染早期的無償獻血者血漿中和正常獻血者血漿中的miRNA（miRNA-372/373）表達差異，進而分析這兩種miRNA與HBV早期感染的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 血漿標本來源于2013年3月-9月天津市內無償獻血者所獻血液的標本留樣，共54份，每份血漿標本量為5 mL，54位無償獻血者均符合《獻血者健康檢查要求》，年齡18～55歲，為隨機抽取。

1.2 試劑與儀器 miRcute miRNA提取試劑盒（北京 TIANGEN），CyDyeTM熒光染料（Amersham Biosciences CyDye），rTaq PCR試劑盒、dNTP（10 mmol/L）、堿性磷酸酶、SYBR Premix EX Taq定量PCR試劑盒（日本TaKaRa），焦碳酸二乙酯DEPC（北京鼎國），RNA酶抑制劑、T4 RNA連接酶、T4多核苷酸激酶、Taq DNA聚合酶（深圳Fermentas），MMLV反轉錄酶（美國Promega），40%PAGE（丙烯酰胺單體：N’N’亞甲雙丙烯酰胺=19：1）（Genview美國），RNase-free水，氯仿，異丙醇，75%乙醇（RNasefree水配制），20×SSC,10×PBS,3 mmol/L氯化鈉，0.3 mmol/L檸檬酸鈉，10%SDS，5 mmol/L醋酸銨，0.5 mmol/L EDTA,1 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）。所有試劑均在有效期內。Version3.0.0.0016(美國PerkinElmer)，超凈工作臺（BCM-8）（蘇州凈化設備公司），iQ5定量PCR檢測儀（美國Bio-Rad），紫外分光光度計（美國Bio-tek），臺式離心機（德國Eppendorf），miniCyclerTMPCR儀（美國MJ Reasearch）。

1.3 方法

1.3.1 分組方法 所抽取的無償獻血者血漿標本均經過ELISA檢測及核酸檢測，分別為第1組（正常組）：ELISA檢測HBsAg及核酸檢測HBV核酸均為陰性的正常的血漿標本18份；第2組（E單陽組）：僅ELISA檢測HBsAg陽性而核酸檢測HBV核酸陰性的血漿標本18份；第3組（EN雙陽組）：ELISA檢測HBsAg及核酸檢測HBV核酸均陽性的血漿標本18份。其中，以上3種血漿標本的其他血液中心常規檢測項目均為陰性，ALT水平正常。追查后兩組36份血漿標本的相應獻血者，均為無明顯癥狀的輕度早期感染者。ELISA檢測由Star全自動加樣儀、FAMI24/30全自動酶免分析儀、anthos 340r酶標儀共同完成；ALT檢測由TBA-120 FR全自動生化儀完成；核酸檢測由Procleix?TRGRIS?核酸檢測分析系統和羅氏cobas s201核酸檢測系統檢測并提供數據。

1.3.2 制備方法 （1）血漿miRNA提取：采用miRcute miRNA提取試劑盒（離心柱型）（北京TIANGEN公司）提取miRNA。（2）miRNA鑒定：采用紫外分光光度法測定miRNA在260 nm和280 nm的吸光度，計算miRNA含量（260 nm的OD=1相當于miRNA含量33 μg/mL），判斷提取的miRNA質量（miRNA OD260/OD280應在1.8至2.1之間，OD260/ OD230應大于2.0）。

1.3.3 實時熒光定量PCR方法 miRNA的定量分析采用基于莖-環引物的實時定量PCR方法[5]。

1.3.3.1 RT制備cDNA：RT引物序列見表1。應用hsa-miRNA-16作為內參照。配制反應體系，總體積為13 μL，其中含小片段RNA 2 μL；miRNA-372，miRNA-373，miRNA-16 1 μL；DEPC水10 μL。65℃變性10min，25℃5min，水浴2～5min。補加以下試劑，總體積為20 μL，其中含5×first stand buffer 4 μL；dNTPs（10 mmol/L）1 μL；RNA酶抑制劑（40 U/μL）1 μL；M-MLV（200 U/μL）1 μL。42℃延伸30 min。70℃滅活10 min。產物保存于-20℃。

1.3.3.2 實時定量PCR確定miRNA-372、miRNA-373的相對表達水平：引物序列見表1。反應體系總體積為20 μL。其中含2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL；PCR Forward Primer（5 pmol/μL）1 μL；PCR Reverse Primer（5 pmol/μL）1 μL；模板（RT產物cDNA）2 μL；DDW6μL。循環體系為：95℃預變性3min；95℃30s，56℃30 s，72℃30 s，40個循環。收集結果，按照以下方法進行數據分析。目的miRNA的定量采用相對法，將2-ΔCt作為目的miRNA在樣品中的相對含量，其中ΔCt=CtmiRNA-CtmiRNA-16。

1.4 統計學分析 所有計量資料按照均數±標準差的方法進行統計。兩組間的比較應用兩獨立樣本t檢驗。3組及以上間的比較應用單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA），組間的進一步兩兩比較應用SNK-q檢驗。兩組變量的相關性分析應用Pearson相關系數法。檢驗統計量P＜0.05時具有統計學差異。

表1 RT引物信息表Tab 1 The information table of RT primers

2 結果

2.1 miRNA-372在3組無償獻血者血漿中的相對表達水平差異 相比較于正常組，miRNA-372在E單陽組、EN雙陽組無償獻血者血漿中的相對表達水平均明顯上調；其中，miRNA-372在EN雙陽組中的相對表達水平比在E單陽組上調更為明顯（圖1）。

圖1 miRNA-372在3組無償獻血者血漿中的相對表達水平差異Fig 1 The differential expressions of miRNA-372 in the plasma of the three groups

2.2 miRNA-373在3組無償獻血者血漿中的相對表達水平差異 相比較于正常組，miRNA-373在E單陽組、EN雙陽組無償獻血者血漿中的相對表達水平均明顯上調；其中，miRNA-373在EN雙陽組中的相對表達水平比在E單陽組上調更為明顯（圖2）。

圖2 miRNA-373在3組無償獻血者血漿中的相對表達水平差異Fig 2 The differential expressions of miRNA-373 in the plasma of the three groups

2.3 miRNA-372在EN雙陽組與相應的HBV DNA拷貝數的相關性 miRNA-372的相對表達水平隨HBV DNA的拷貝數增加而增加，與相應的HBV DNA拷貝數呈正相關性（圖3）。

圖3 miRNA-372與HBV DNA拷貝數的相關性Fig 3 The correlation between the miRNA-372 and the copy number of HBV DNA

3 討論

圖4 miRNA-373與HBV DNA拷貝數的相關性Fig 4 The correlation between the miRNA-373 and the copy number of HBV DNA

3.1 近年來，miRNA-371-373簇的調節功能引起了人們的關注，但其作用機制還有待深入研究，相關工作還有待繼續開展。曾洋等[6]報道，miR-373參與調控Flk1+MSC向骨細胞分化；武衛華等[7]也證實，人工構建的has-miRNA-373載體經轉染后可增加腫瘤細胞中E-鈣黏蛋白的表達量；同時，劉琳等[8]的研究發現，miRNA-373在宮頸癌組織和Hela細胞中低表達，又起到了抑癌基因的作用。在HBV感染的肝臟組織和HepG2.2.15細胞中，miRNA-373和miRNA-371-373簇的表達均顯著上調[4]。人們通過研究發現，在1.3×HBV轉染的HepG2細胞中，miRNA-373和miRNA-371-373簇的高表達可以通過靶向核因子I/B，刺激HBV蛋白和HBV核心DNA的產生，從而促進HBV的復制。由于miRNA是在細胞中產生的，而循環miRNA來自于凋亡或壞死的細胞、細胞的主動釋放以及循環細胞的裂解，本研究應用實時熒光定量PCR方法檢測miRNA-372/ 373在各組無償獻血者血漿中的相對表達水平，發現相比較于正常組，miRNA-372/373在E單陽組、EN雙陽組無償獻血者血漿中的相對表達水平均明顯上調（圖1～2），由此看出，HBV感染者血漿中的miRNA-372/373與 HBV感染的肝臟組織和HepG2.2.15細胞中的miRNA-372/373表現是一致的。這一結果提示血漿中的miRNA-372/373與HBV感染密切相關。

另外，miRNA-372/373在EN雙陽組的相對表達水平比在E單陽組上調更為明顯。這是由于相對于E單陽組，EN雙陽組獻血者體內有較活躍的病毒復制且拷貝數較高，這一結果初步表明了血漿miRNA-372/373的相對表達水平不僅與HBV的感染相關而且與HBV的復制及活動性相關。

3.2 將EN雙陽組中的miRNA-372/373相對表達水平與HBV DNA拷貝數做相關性分析（圖3～4），miRNA-372/373的相對表達水平與HBV DNA拷貝數呈正相關關系。在組織和細胞中，miRNA-373和miRNA-371-373簇的表達水平與HBV DNA拷貝數呈正相關，miRNA-373和miRNA-371-373簇的高表達可以刺激HBV蛋白和HBV核心DNA的產生，從而促進HBV的復制[4]。因此我們推測，在血漿中，miRNA-373和miRNA-371-373簇也產生同樣的作用，miRNA-372/373相對表達水平的高低可以反應此時的HBV復制情況。同時，miRNA-373的相對表達水平與HBV DNA拷貝數的正相關性更為明顯。

綜上所述，miRNA-372、miRNA-373的相對表達水平與HBV早期感染密切相關，有望為HBV早期感染的診斷和治療提供新的依據和方法。當然，對于臨床研究來說，本試驗中的血漿樣品數量偏少，只有54份，因此本研究得出的結論有一定的局限性，僅供參考，相關研究還有待進一步深入探討。

[1] Lee R C,Feinbaum R L,Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J].Cell,1993,75(5)：843

[2] Nikaki A,Piperi C,Papavassiliou A G.Role of microRNAs in gliomagenesis：targeting miRNAsin glioblastoma multiforme therapy[J].Expert Opin Investig Drugs,2012,21(10)：1475

[3] Kwak M S,Lee D H,Cho Y,et al.Association of polymorphism in Pri-microRNAs-371-372-373 with the occurrence of hepatocellular carcinoma in hepatitis B virus infected patients[J]. PLoS One,2012,7(7)：e41983

[4]Guo H Y,Liu H Y,Mitchelson K,et al.MicroRNAs-372/373 promote the expression of hepatitis B virus through the targeting of nuclear factor I/B[J].Hepatology,2011,54(3)：808

[5] Chen C F,Ridzon D A,Broomer A J,et al.Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR[J].Nucleic Acids Res,2005, 33(20)：e179

[6]曾洋，劉星霞，林瑞竹，等．microRNA-373參與調控人脂肪來源間充質干細胞成骨分化[J]．基礎醫學與臨床，2012，32（2）：119

[7] 武衛華，孔璟，葉彬．hsa-mir-373對腫瘤細胞中E-鈣黏蛋白表達的影響[J]．生物技術通報，2011（8）：167

[8]劉琳，王月玲，王江芬．miR-21、miR-126、miR-143和miR-373在正常宮頸組織、宮頸癌組織及Hela細胞中的表達差異[J]．四川大學學報：醫學版，2012，43（4）：536

（2015-04-23收稿）

Differential expression of miRNA-372/373 in plasma between the normal donors and the HBV donors at early stage

AN Peng-peng1，TANG Hua2，GUO Jun-fei2
（1.Department of Quality Control,Tianjin Blood Center,Tianjin 300110，China；2.Tianjin Life Science Research Center,Tianjin Medical University,Tianjin 300070，China）

Objective：To explore the relationship between the miRNA-372/373 levels in plasma and the early-stage infection of HBV,to uncover the potential of miRNA-372/373 in the diagnosis of the early-stage infection of HBV.Methods：Blood samples for miRNA detecting were collected from 54 donors who donated blood from 2013.3 to 2013.9 in Tianjin.All the samples were divided into 3 groups：eighteen samples were Normal;18 samples were ELISA testing(+)and NAT(-)(HBV-S);the last 18 samples were ELISA testing(+)and NAT(+)(HBV-D).Quantization of miRNA-372 and miRNA-373 in all the 54 plasma samples were performed using quantitative RT-PCR. At last,compared thederegulated miRNA(miRNA-372/-373)in the plasma of the three groups respectively,and the expression patterns of miRNA-372 and miRNA-373 were analyzed using statistical methods;the correlation between the expression level of miRNA-372/-373 and the copy number of HBV DNA in NAT(+)plasma was statistically analyzed.Results：Compared with the Normal,miRNA-372 and miRNA-373 in both HBV-S and HBV-D were up-regulated.Furthermore,both miRNA-372 and miRNA-373 were up-regulated more significantly in HBV-D than in HBV-S.Moreover,the levels of both miRNA-372 and miRNA-373 were positively correlated with the copy number of HBV DNA in HBV-D.Compared with miRNA-372,miRNA-373’s positive correlation with the copy number of HBV DNA was significantly higher.Conclusion：The correlation between miRNA-372/373 in plasma and the early-stage infection of HBV is high, indicating their potential values in the early-stage diagnosis of HBV infection.

microRNA;miRNA-372;miRNA-373;the early-stage infection of HBV

R457.1

A

1006－8147（2015）06-0503-04

安蓬蓬（1979-），女，主治醫師，碩士在讀，研究方向：輸血；通信作者：湯華，E-mail：htang2002@yahoo.com。