基于納米粒子的TR-FRET傳感器用于miRNAs的無擴增檢測

張毅，譚加興，葉彥愷，姜煒，孫艷華，沈萬秋，曹海燕，靳美娜，秦楠，段宏泉

（天津醫科大學藥學院醫用化學教研究，天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津300070）

論著

基于納米粒子的TR-FRET傳感器用于miRNAs的無擴增檢測

張毅，譚加興，葉彥愷，姜煒，孫艷華，沈萬秋，曹海燕，靳美娜，秦楠，段宏泉

（天津醫科大學藥學院醫用化學教研究，天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津300070）

目的：建立一種基于納米粒子的時間分辨（TR）熒光共振能量轉移（FRET）生物傳感器用于miRNAs的無擴增檢測。方法：以寡核苷酸單鏈probe I偶聯GdF3：Tb3+納米粒子作為供體，以寡核苷酸單鏈probe II偶聯金（Au）納米粒子作為受體，利用供體與受體之間的FRET檢測目標miRNA hsa-miR-122-5p濃度，并通過設置多功能酶標儀的檢測延遲去除自發熒光背景以提高靈敏度。結果：該傳感器能夠高靈敏度、高特異性地檢測目標分子，并且對于光照有良好的耐受性，而且能夠避免自發熒光干擾。對hsa-miR-122-5p的檢測線性范圍為0.1 fmol/L～100 pmol/L，與同類型的RNA熒光傳感器的檢測限具有可比性。結論：基于納米粒子的TR-FRET生物傳感器用于miRNAs的無擴增檢測具有良好的靈敏度和特異性。

鑭系金屬摻雜；納米粒子；時間分辨；熒光共振能量轉移；miRNA；傳感器；無擴增檢測

微核糖核酸（miRNAs）是一類由內源基因編碼的、長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它在細胞分化、增殖和凋亡以及腫瘤的發生和發展等病理過程中都起到非常重要的調控作用[1]。有研究表明，某些miRNAs可以介導腫瘤的擴增和擴散，與多藥耐藥密切相關，可以調節癌癥轉移過程中多個基因的表達，這些miRNAs很有可能成為預測癌癥的重要指標[2-3]。目前，miRNAs的檢測手段主要包括反轉錄聚合酶鏈反應[4]、微陣列[5]、電化學[6]、熒光法[7-8]等。其中，相比其他3種方法，熒光法具有成本低廉、靈敏度高、操作簡單等明顯優勢。本文旨在報道一種基于鑭系金屬摻雜納米粒子的時間分辨（TR）型熒光共振能量轉移（FRET）生物傳感器用于檢測miRNAs。該傳感器的優勢在于其能夠有效地避免來自體液、細胞和組織樣本的散射光以及自發熒光干擾，無需擴增miRNAs，無需避光保存。

1 材料與方法

1.1 試劑及樣本 所有合成RNA及DNA均購于金唯智生物科技有限公司（北京）。其他所用試劑均為分析純，實驗用水由Labconco WaterPro水系統制備。GdCl3×6H2O，TbCl3×6H2O，NH4F，聚丙烯酸（PAA，分子量～2 000），1－乙基－（3－二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺（EDC），N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）購自上海阿拉丁試劑有限公司。鹽酸，EDTA，Na2HPO4×12H2O，NaH2PO4×2H2O，NaOH，NaCl，MgCl2,檸檬酸鈉購自天津光復試劑有限公司。酵母tRNA購自北京華越洋生物科技有限公司。RNA提取試劑盒購于北京百泰克生物技術有限公司。qRT-PCR試劑盒為TaqManRMicroRNA Assay，SM，貨號4427975。一位健康人和一位慢性淋巴性白血病（CCL）患者血清各兩份，購于中國醫學科學院血液學研究所血液病醫院（天津）。本工作所涉及的核苷酸序列見表1。

表1 核苷酸序列Tab 1 Sequences of RNA and DNA

1.2 儀器 Thermo Scientific Varioskan Flash光譜掃描多功能讀數儀，雷勃爾LG16-A高速臺式離心機，熒光定量PCR儀ABI7000。

1.3 實驗方法

1.3.1 PAA-GdF3：Tb3+納米粒子的合成 本合成參考了文獻方法[9]，并做了部分改動。具體步驟如下：在50 mL圓底燒瓶中，向12 mL超純水和4.0 mL乙二醇混合溶劑中加入0.1 mmol GdCl3×6H2O、80 mg PAA、2.0 μmol TbCl3×6H2O，攪拌至均勻透明后加熱至50℃。另取一支15 mL試管中加入2.0 mL乙二醇、5.0 mL超純水和0.3 mmol NH4F，室溫攪拌至均勻透明后加熱至50℃，趁熱將此NH4F溶液滴加入上述圓底燒瓶中，持續反應30 min后2 000 r/min離心5 min，收集固體產物，并分別用超純水和乙醇各洗滌兩遍，真空干燥過夜。最后得到PAA修飾的GdF3：Tb3+納米粒子白色粉末狀產物。

1.3.2 寡核苷酸單鏈probe I與PAA-GdF3：Tb3+納米粒子偶聯 寡核苷酸單鏈probe I的5’端帶有氨基，GdF3：Tb3+納米粒子表面有大量羧基，可以通過EDC和NHS催化于水相中實現氨基和羧基的縮合[10]。將步驟1.3.1所得粉末配制成5%w/v水溶液，取100 μL上述水溶液、5 nmol寡核苷酸單鏈probe I（5′-NH2-（CH2）6-TGGAGTGTG AC-3′）、30 mg EDC、5 mg NHS加入到1 mL PBS（0.1 mol/L，pH 7.4）中，混合均勻后室溫下電磁攪拌反應24 h。產物以2 000 r/ min離心5 min后以PBS（0.1 mol/L，pH 7.4）洗滌2次，并于PBS（10 mmol/L，pH 7.4，100 mmol/L NaCl）中4°C儲存，此溶液為偶聯有寡核苷酸單鏈probe I的GdF3：Tb3+納米粒子溶液。

1.3.3 制備寡核苷酸單鏈probeⅡ修飾的金納米粒子 參考文獻方法[11]，利用檸檬酸鈉還原HAuCl4制備新鮮的膠體金納米粒子溶液并將寡核苷酸單鏈probeⅡ（5′-AATGGTGTTTG-（CH2）6-SH-3′）與金納米粒子偶聯，最后將其分散于PBS（10 mmol/L，pH 7.4，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2）的緩沖溶液中，儲存于4°C備用。

1.3.4 FRET傳感器構建 參考文獻實驗條件[12]，通過核酸雜交反應偶聯上述兩種納米粒子。取100 μL偶聯有寡核苷酸單鏈probeⅠ的GdF3：Tb3+納米粒子溶液，加入200 μL寡核苷酸單鏈probeⅡ修飾的金納米粒子溶液和5 nmol probeⅢ（5′-CAAACACC ATTGTCACACTCCA-3′），37°C、3 000 r/min振蕩約1 h，以熒光光度計監測543 nm處的熒光變化直至降低至不再變化。2 000 r/min離心5 min，小心棄去上清液，以PBS（10 mmol/L，pH 7.4，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2）洗滌，再重復兩次上述離心和洗滌過程以去除未結合的probeⅢ和金納米粒子，得到FRET傳感器的PBS溶液。

1.3.5 檢測原理 圖1顯示了本傳感器的工作原理如下：以寡核苷酸單鏈probeⅠ偶聯GdF3：Tb3+納米粒子作為FRET供體，以寡核苷酸單鏈probeⅡ偶聯金（Au）納米粒子作為FRET受體，先利用probeⅢ與probeⅠ和Ⅱ的堿基互補作用將供體與受體連接并建立高效的FRET，使GdF3：Tb3+納米粒子熒光淬滅，此混合體系即為檢測混合液。以hsamiR-122-5p為模式目標分子，當向上述檢測混合液中加入含有目標RNA的待測樣本后，probeⅢ與目標RNA結合，原有的FRET被打破，GdF3：Tb3+納米粒子熒光恢復，即實現off-on檢測模式。通過設置多功能酶標儀的檢測模式為 time-resolve spectra，延遲時間為100 μs、門時間為1 ms，去除短壽命的自發熒光背景，檢測GdF3：Tb3+納米粒子在543 nm處的熒光發射強度，利用標準曲線法和標準加入法計算樣本中目標分子濃度。表1中列出了實驗所涉及核酸序列，其中5p-1x、5p-1y及5p-1z均為目標miRNA hsa-miR-122-5p的單堿基差異核酸序列。

圖1 基于鑭系金屬摻雜納米粒子的時間分辨FRET生物傳感器用于has-miR-122的無擴增檢測原理示意圖Fig 1 Schematic diagram of the direct non-amplification detection ofmiRNAsbytime-resolvedFRETassaybasedonlanthanidedopednanocrystals

1.3.6 樣品準備 （a）用于TR-FRET檢測的血清處理[13]：實驗前，1.0 mL血清樣本中加入100 μL 100 mg/mL酵母tRNA以保護內源miRNAs不被核酶降解。以PBS（25 mmol/L，pH 7.0，25 mmol/L NaCl）將血清樣本稀釋 10倍，95℃加熱 15 min以釋放miRNAs。在96孔板的樣品孔內，加入90 μL人工合成hsa-miR-122-5p的PBS溶液或稀釋血清，再加入10 μL FRET傳感器，于室溫下震蕩孵育1 h后檢測。（b）陰性對照實驗：以5.1 mg/mL人血清白蛋白代替血清，后續處理同上。（c）對照方法：qRT-PCR，利用RNA提取試劑盒提取血清全部RNA，并以qRT-PCR試劑盒檢測hsa-miR-122-5p。

1.3.7 光譜掃描條件 以272 nm為激發波長，掃描400～700 nm的熒光發射光譜；以543 nm作為發射波長，掃描220～400 nm的熒光激發光譜。TRFL（時間分辨熒光）分析測試：以272 nm為激發波長，測定543 nm處的熒光，延遲時間（delay time）為100 μs，檢測門時間（gate time）為1 ms。

2 結果

2.1 PAA-GdF3：Tb3+納米粒子的熒光性質 本工作通過一步溶劑熱法制備了PAA-GdF3：Tb3+納米粒子。使用分子量為2 000的PAA作為表面封端劑以控制粒子生長，并藉此賦予納米粒子水溶性及生物相容性。本工作中所合成的PAA-GdF3：Tb3+納米粒子易溶于水，水溶液澄清透明。該納米粒子在水溶液、300 mmol/L NaCl溶液及pH 5.0～12.0磷酸鹽緩沖液中，在室溫下、空氣中、不避光保存1個月，既沒有發生絮凝也沒有沉淀，說明此納米粒子可以耐受多種生理條件。

圖2a為PAA-GdF3：Tb3+納米粒子水溶液的熒光激發光譜、發射光譜。該納米粒子在272 nm處有尖銳激發線，對應Gd3+離子向的躍遷，相比之下Tb3+的激發線非常微弱。在543 nm處有最大熒光發射，對應Tb3+離子5D4向7F5的特征躍遷發射，紫外燈照射下該溶液發射綠色熒光（圖2a）。上述結果說明，GdF3：Tb3+納米粒子主體Gd3+吸收光子，并向摻雜Tb3+轉移能量，進而實現摻雜元素Tb3+的熒光發射。本工作檢測了PAA-GdF3：Tb3+納米粒子水溶液在543 nm的熒光衰減曲線（圖2b），經擬合該熒光衰減曲線符合雙指數函數，所制備納米粒子的平均熒光壽命為1.2 ms，此熒光壽命遠大于生物樣本自發熒光壽命，足以利用時間分辨技術扣除短壽命熒光背景干擾。金納米粒子在400 nm到600 nm范圍內有廣泛吸收，與PAA-GdF3：Tb3+納米粒子的發射光譜有較好的交疊，表明二者之間有實現FRET的條件。

圖2 PAA-GdF3：Tb3+納米粒子水溶液的熒光激發光譜、發射光譜以及熒光衰減曲線Fig 2 Excitation spectra,emission spectra and decay curve of the as-prepared PAA-GdF3：Tb3+nanocrystals solution

2.2 線性范圍及特異性 向檢測混合液中加入人工合成目標miRNA hsa-miR-122-5p，檢測混合液在543 nm處的熒光發射強度發生了有規律的增加。在0.1 fmol/L～100 pmol/L濃度范圍內，所加入miRNA濃度的負對數（-logCmiRNA）與檢測混合液的熒光強度呈線性關系，并且相關系數r2＞0.99（圖3）。

圖3 目標miRNA hsa-miR-122-5p對檢測混合液熒光強度（543 nm）的影響Fig 3 Effect of target miRNA hsa-miR-122-5p on the fluorescence intensity at 543 nm of detecting mixture

由于miRNA家族成員之間具有高度的序列相似性，因此，本工作還考察了檢測體系的特異性，包括對單堿基差異的識別能力和前體miRNA的交叉雜交（圖4a），各寡核苷酸鏈的堿基序列見表1。向檢測混合液中分別加入目標miRNA hsa-miR-122-5p及其單堿基差異核酸序列5p-1x、5p-1y及5p-1z各200 pmol/L，檢測混合液在543 nm處的熒光發射強度均有增加，但單堿基差異類似物與probeⅢ交叉雜交所引起的信號變化不足20%，其中5p-1y引起的交叉雜交最大，為18.2%。前體miRNA是一種含有成熟miRNA序列的穩定發卡結構RNA，也可能會對成熟miRNAs檢測產生一定的干擾，因此，本工作中對pre-hsa-miR-122-5p的干擾做了進一步考察。200 pmol/L pre-hsa-miR-122-5p產生的信號與hsa-miR-122-5p相比為10.2%。以上結果說明本方法不僅能夠區分單堿基差異序列，而且能夠有效區分成熟miRNAs與其前體miRNAs。

圖4 miRNA熒光傳感器對不同樣本的時間分辨熒光信號響應Fig 4 TR-fluorescence response of miRNA sensor to different samples

2.3 血清內源hsa-miR-122檢測 將本文所開發的熒光傳感器應用于人血清內源hsa-miR-122的檢測。圖4b顯示，CCL患者血清內源hsa-miR-122稍多于健康人，與qRT-PCR分析結果一致。以上試驗說明：本傳感器能夠從血清背景中成功檢出目標miRNAs的豐度。

3 討論

熒光共振能量轉移（FRET）是在熒光供體的激發狀態下由一對偶極子介導的能量從供體向受體轉移的非輻射過程[14]。FRET受體和供體之間依靠生物偶聯作用相結合時，彼此間距只有幾個納米，二者之間的能量轉移過程可以通過掃描供體和受體的熒光光譜得以檢測[15-16]。FRET效率對因目標分子濃度變化引起的受體-供體間距在納米尺度的差異具有優越的靈敏度，因此，近年來在生物分析領域，尤其是在核酸雜交的檢測中，FRET技術發揮了巨大的作用。然而，目前FRET技術普遍應用的有機小分子熒光供體光漂白嚴重；而且，基于穩態熒光的傳統FRET分析中，當以紫外光激發時，生物樣本的自發熒光干擾十分嚴重[15,17]。

稀土摻雜納米粒子是一類新興的熒光傳感器材料，與有機染料和半導體量子點相比，稀土摻雜納米粒子有很多更優越的化學和光學性質，例如：生物毒性低、有效Stokes位移大、發射峰狹窄、熒光壽命長以及耐光漂白能力強。由于稀土摻雜納米粒子適用于時間分辨熒光檢測技術，因此，有望將此材料應用于非侵襲性、無損傷的實時在體疾病監測[18-19]。

本工作以寡核苷酸單鏈probeⅠ偶聯GdF3：Tb3+納米粒子作為FRET供體，以寡核苷酸單鏈probeⅡ偶聯金納米粒子作為FRET受體，以hsa-miR-122-5p為模式目標分子，通過設置多功能酶標儀的檢測延遲去除自發熒光背景，利用供體與受體之間的FRET檢測樣本中目標分子濃度。該傳感器能夠高靈敏度、高特異性地檢測目標分子，并且對于光照有良好的耐受性，能夠避免自發熒光干擾。對hsa-miR-122-5p的檢測線性范圍為0.1 fmol/L～100 pmol/L，與同類型的RNA熒光傳感器的檢測限具有可比性。將該傳感器應用于血清內源hsa-miR-122檢測時，能夠有效檢出樣本中目標物的豐度差異。

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（2015-08-06收稿）

Direct non-amplification detection of miRNAs by time-resolved FRET sensor based on lanthanide-doped
nanocrystals

ZHANG Yi,TAN Jia-xing,YE Yan-kai,JIANG Wei,SUN Yan-hua,SHEN Wan-qiu,CAO Hai-yan,JIN Mei-na,QIN Nan,DUAN Hong-quan（Department of Medical Chemistry,College of Pharmacy,Tianjin Medical University,Tianjin Key Laboratory on Technologies Enabling Development of Clinical Therapeutics and Diagnostics（Theranostics）,Tianjin 300070,China）

Objective：To develop a miRNA detection method based on the time-resolved（TR）fluorescence resonance energy transfer（FRET）assay.Methods：The GdF3：Tb3+nanocrystals were coupled with nucleotide probe I as donor,and gold nanocrystals with nucleotide probeⅡas acceptor.miRNA hsa-miR-122-5p was detected by time-resolved FRET assay,and the short lived background luminescence such as auto-fluorescence was suppressed when determining the long lived fluorescence of Tb3+by setting appropriate delay time and gate time.Results：The TR-FRET based miRNA sensor was sensitive and selective to hsa-miR-122-5p with a dynamic linear range of 0.1 fmol/ L-100 pmol/L,which was compatible with that of the same type of sensors.Furthermore,the GdF3：Tb3+nanocrystals were stable to light irradiation and their lifetime was long enough to avoid autofluorescence.Conclusion：The TR-FRET miRNA sensor for non-amplification detection of hsa-miR-122-5p based on GdF3：Tb3+nanocrystals,is sensitive and selective.

lanthanide-doped;nanocrystals;time-resolved;fluorescence resonance energy transfer;miRNA;sensor;non-amplification detection

R9

A

1006－8147（2015）06-0521-04

國家自然科學基金資助項目（21305103，21373151，31200753，21205087）

張毅（1982-），女，博士，研究方向：納米材料于生化分析的應用；通信作者：段宏泉，E-mail:duanhq@tijmu.edu.cn。