飼料中添加葉酸和VB12對中華絨螯蟹幼蟹生長、非特異性免疫和抗病力的影響

魏建軍張 帆田文靜李二超吳強強陳立僑

(1. 華東師范大學生命科學學院, 上海 200241; 2. 通威股份有限公司, 成都 610041)

飼料中添加葉酸和VB12對中華絨螯蟹幼蟹生長、非特異性免疫和抗病力的影響

魏建軍1張 帆1田文靜1李二超1吳強強2陳立僑1

(1. 華東師范大學生命科學學院, 上海 200241; 2. 通威股份有限公司, 成都 610041)

為研究葉酸和VB12協同作用對中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)幼蟹生長、非特異性免疫和抗病力的影響, 選取初始體重為(2.57±0.03) g的幼蟹600只, 隨機分成4組, 每組5個重復, 每個重復30只幼蟹, 分別投喂對照組(不添加葉酸和 VB12), 單一 VB12組(0.2 mg/kg), 單一葉酸組(2.3 mg/kg)和聯合處理組(0.2 mg/kg VB12+ 2.3 mg/kg葉酸)的飼料8周。在養殖實驗結束后, 先統計成活率和稱重, 然后從每個處理組隨機選取30只幼蟹, 用2×108CFU/mL的嗜水氣單胞菌注射攻毒2周。實驗結果表明: 幼蟹的增重率、特定生長率、飼料效率和存活率在聯合處理組最高, 顯著高于對照組(P＜0.05), 但與單一葉酸或 VB12組相比不存在顯著差異(P＞0.05)。聯合處理組的血清酚氧化酶活性顯著高于對照組(P＜0.05), 但與單一葉酸或VB12組也無顯著性差異(P＞0.05)。同時, 聯合處理組的血清酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、溶菌酶活性和血細胞總數等指標最高, 其次是單一葉酸組和VB12組, 而對照組最低。投喂聯合處理組飼料幼蟹的肝胰腺超氧化物歧化酶活性最高, 而丙二醛含量和累積死亡率最低。以上結果表明, 葉酸和 VB12對幼蟹的生長、生理代謝和免疫性能均可能有互補和協同作用, 養殖生產中建議飼料中葉酸和VB12添加量分別為2.3 mg/kg和0.2 mg/kg。

中華絨螯蟹; 葉酸; VB12; 生長; 非特異性免疫力; 嗜水氣單胞菌

葉酸作為一碳單位的供體和受體, 以其輔酶四氫葉酸的形式參與氨基酸、核苷酸代謝等許多生理反應[1]。葉酸是細胞分裂和增殖所必需的微量成分[2]。當葉酸缺乏或不足時, 水生動物會表現出明顯的缺乏癥, 如貧血、生長緩慢、飼料轉化率低、死亡率高和免疫力低下等癥狀[3]。維生素B12是血細胞正常發育和成熟、脂肪酸代謝、同型半胱氨酸甲基化轉變為蛋氨酸, 以及四氫葉酸正常循環等所必需的[3]。已有研究表明, 維生素 B12的缺乏癥與葉酸的缺乏癥相似[3]。

葉酸和維生素B12都是水生動物維持正常生理狀態所必需的微量營養素。對于水生脊椎動物, 葉酸的需求量僅見于虹鱒(Oncorhynchus mykiss) (0.3—0.6 mg/kg)[4]、斑點叉尾

(Ictalurus punctatus) (1.5 mg/kg)[5]、奧尼羅非魚(Oreochromis niloticus × Oreochromis aureus) (0.82 mg/kg)[6]和石斑魚(Epinephelus malabaricus) (0.8 mg/kg)[7]等種類; 而維生素B12需求量的報道也非常有限, 僅限于大西洋鮭(Oncorhynchus keta) (0.015—0.02 mg/kg)[9]、黃條(Serioda lalandi) (0.053 mg/kg)[10]和草魚(Ctenopharyngodon idella) (0.094 mg/kg)[11]。對于水生無脊椎動物, 斑節對蝦(Penaeus monodon)對葉酸和維生素 B12的適宜需求量分別為1.9—2.1 mg/kg[2]和0.2 mg/kg[12]; 而皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai Ino)對葉酸的需求量為2.62—5.29 mg/kg[8]。此外, 根據本實驗室對葉酸和維生素 B12需求量的研究, 中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)幼蟹對葉酸和 VB12的適宜需求量分別為2.29—2.90 mg/kg和0.20—0.22 mg/kg[13]。綜合已有的研究結果, 水生脊椎動物對葉酸和維生素 B12的需求量比水生無脊椎動物要低。

在水生動物中, 有關葉酸和維生素 B12可能交互作用的研究非常有限。John和Mahajan[14]報道, 用不添加葉酸和維生素 B12的飼料投喂南亞野鯪(Labeo rohita Ham)幼魚[(2.35±0.82) g] 105d后, 發現幼魚生長緩慢、飼料轉化率低并呈現明顯的貧血癥狀, 表明葉酸和維生素 B12對魚類的正常代謝和生長有互補和交互作用。Shiau和 Lung[12]報道, 投喂不添加葉酸和維生素 B12飼料的斑節對蝦[(0.57±0.03) g] 在 8周后生長性能最差, 同樣表明葉酸和維生素 B12在對蝦的生理代謝中可能有互補和協同作用。但迄今有關葉酸和維生素 B12對甲殼動物免疫性能的可能協同效應尚未見報道。本實驗以中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)幼蟹為研究對象,研究了添加葉酸和維生素 B12對幼蟹的生長、體成分、免疫性能和抗病力的影響, 結果可為中華絨螯蟹高效配合飼料的研制和人工養殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

本實驗以不含維生素的酪蛋白和明膠(Sigma-Aldrich Co., 上海, 中國)為蛋白源, 以魚油(Xiamen Xinsha Pharmaceutical Co. Ltd, 廈門, 中國)和大豆油(金龍魚有限公司, 上海, 中國)為脂肪源, 玉米淀粉為糖源, 飼料的基礎配方見表1。同時, 補充添加含甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸和甜菜堿的誘食劑, 以提高幼蟹的食欲和攝食效率。飼料中復合維生素的添加參考已有對蝦蟹類的維生素營養研究結果, 復合礦物質的添加參考 Shiau和 Hsu[15]的研究。在飼料中添加葉酸和VB12分別為0和0 mg/kg (對照組)、0和0.2 mg/kg (單一VB12組)、2.3和0 mg/kg (單一葉酸組)、2.3和0.2 mg/kg (聯合處理組)。飼料中葉酸和 VB12的實際含量采用微生物分析法測定分別為0.08和2.39 mg/kg、0和0.19 mg/kg[16]。實驗飼料的準備和儲存參照陳立僑等[17]報道的方法。

1.2 實驗動物馴化、分組和管理

養殖實驗為期 8周, 在上海市金山區漕涇鎮特種水產養殖基地進行。實驗用幼蟹購于上海崇明養殖場, 實驗開始前, 將所購幼蟹放在水泥池(6.0 m × 3.0 m × 1.5 m)中暫養2周, 暫養期間投喂商業飼料(9812, Shanghai Harmony Feed CO., LTD.)。然后, 挑選規格接近、完整活潑、平均體重為[(2.57±0.02) g]的幼蟹隨機分成4組, 每組5個平行, 置于20個容積為500 L的聚乙烯塑料箱中, 每箱放養30只, 并且在每箱中放置6塊瓦片和足量的PVC管作為躲避物。養殖期間, 每天用相應的飼料飽食投喂兩次(09:00和17:00), 同時設一空白投飼組, 以計算扣除溶失率后的攝食量。及時將死蟹取出并稱重, 并于下次投喂前回收殘餌, 將水體中的糞便和殘餌吸走,并補充經消毒、除氯和充分曝氣處理的養殖用水,每天換水量1/3左右。在養殖期間, 不間斷的對養殖水體充氧, 水體溶解氧為 7.7—8.2 mg/L, 水溫為(28±2)℃, pH為7.5—7.9, 總氨氮≤0.01 mg/L。8周結束后, 每個處理組選取30只幼蟹隨機放入3個塑料箱中, 用嗜水氣單胞菌感染進行2周的攻毒實驗。

表1 基礎飼料配方Tab. 1 The composition of basal diets

1.3 取樣、樣品處理和分析

在養殖實驗結束后, 所有幼蟹停止投喂 24h,對每個水箱中幼蟹的分別進行計數和稱重, 相關生長指標的計算公式如下:

其中, Wt和W0分別為養殖實驗結束和開始時幼蟹的平均體重(g), N0實驗開始時幼蟹的個體數(只), Nt為養殖過程中幼蟹的死亡數, 而 WF則為經溶失校正后的實際攝食量(g), 即在養殖實驗條件下, 將各組飼料分別投喂到不含幼蟹的水箱中, 并于下次投喂時回收, 用于WF的計算。

稱重后, 隨機從每個水箱中選取 5只幼蟹保存于–20℃冰箱中用于體成分的測定。其中, 粗蛋白的含量采用杜馬斯燃燒法(Leco FP-528), 粗脂肪的測定采用索氏抽提法(2055 Soxhlet Avanti; Foss Tecator, Hoganas Sweden), 水分測定采用 105℃烘干至恒重法, 而灰分則先用電爐炭化后, 550℃馬弗爐灼燒至恒重法。

剩余的幼蟹置于冰上麻醉后, 用 1 mL的注射器于第三步足基部抽取血淋巴。所收集的血淋巴一部分與等體積的抗凝劑(0.20 mol/L NaCl, 0.17 mol/L葡萄糖, 50.00 mmol/L 檸檬酸三鈉, 43.33 mmol/L檸檬酸, 16.67 mmol/L EDTA-Na2, pH 6.5)混勻, 用相差顯微鏡進行血淋巴細胞的計數。另一部分不添加抗凝劑, 置于 4℃冰箱中過夜, 自然凝結, 然后, 5000 r/min離心10min, 分離血清用液氮速凍后, 保存于–80℃冰箱中, 用于酚氧化酶(Phenoloxidase, PO)、溶菌酶(Lysozyme, LZM)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase, ACP)和堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)的測定。其中, 酚氧化酶的測定依據Ashida[18]的方法, 溶菌酶的測定根據Hultmark等[19]改進的方法, 酸性和堿性磷酸酶則依照Gonzalez等[20]改進的方法。所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所,具體操作按照使用說明進行。

冰浴麻醉后的幼蟹, 立即解剖取肝胰腺, 液氮速凍后, 置于–80℃冰箱保存, 用于葉酸和 VB12含量以及超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性和丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量的測定。其中, 葉酸和 VB12含量的測定采用免疫酶聯法(伊萊瑞特生物科技有限公司), 超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的測定分別參照 Wang和 Chen[21]、Uchiyama和Mihara[22]的方法, 試劑盒購于南京建成生物工程研究所, 按具體說明進行操作。

1.4 攻毒實驗

攻毒實驗所用嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)菌種由華東師范大學生命科學學院實驗中心提供。實驗開始前, 分別采用1010、109、108、107、106和105CFU/mL濃度的嗜水氣單胞菌菌懸液注射幼蟹, 每只0.05 mL, 以0.86%的生理鹽水作為對照,統計 96h內幼蟹的累積死亡率, 嗜水氣單胞菌對幼蟹的96h半致死濃度為2.0×108CFU/mL。然后, 利用 2.0×108CFU/mL的嗜水氣單胞菌注射各個水箱中的幼蟹進行攻毒實驗, 實驗為期 2周。在實驗結束后, 統計各水箱中幼蟹的累計死亡率, 以此指標評價幼蟹抵抗嗜水氣單胞菌感染的能力。

1.5 數據分析

所有實驗數據采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA), 若存在顯著差異(P＜0.05), 再用Duncan’s多重比較法來確定組間差異, 所得結果均以 5個平行處理組數據的平均值±標準誤(Mean± SE)表示。

2 結果

2.1 生長和存活

從表 2可見, 投喂聯合處理組飼料的幼蟹, 其增重率、特定生長率、飼料效率和存活率最高, 并且顯著高于對照組(P＜0.05), 但與單一葉酸組、單一VB12組的蟹沒有顯著性差異。

2.2 體成分

由表 3可知, 投喂聯合處理組和單一葉酸組飼料的幼蟹, 其體粗蛋白含量要顯著高于其他各組(P＜0.05)。投喂對照組飼料的幼蟹, 其粗脂肪含量要顯著低于其他各實驗組(P＜0.05), 而各組蟹體的水分和灰分則不存在顯著差異。

2.3 非特異性免疫指標

幼蟹的血清酚氧化酶、溶菌酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性和血細胞總數的測定結果如表4所示。其中, 投喂聯合處理組飼料幼蟹的酚氧化酶最高, 顯著高于對照組(P＜0.05), 但與單一葉酸組和單一VB12組均無顯著性差異。溶菌酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和血細胞總數均以聯合處理組最高, 其次是單一葉酸組和單一VB12組, 均不添加的對照處理組則最低。

2.4 抗氧化指標

由表 5可知, 肝胰腺超氧化物歧化酶活性在聯合處理組最高, 其次是單一葉酸組和單一 VB12組,對照處理組最低。然而, 丙二醛的含量變化趨勢則與之相反, 在聯合處理組幼蟹肝胰腺丙二醛的含量最低, 其次是單一添加葉酸組和單一 VB12組, 對照組的最高。

2.5 抗病力

由圖 1可知, 在各實驗組中, 聯合處理組的累積死亡率最低, 僅為 26.67%, 并且顯著低于對照組的46.67% (P＜0.05), 單一添加葉酸和VB12處理組的累積死亡率分別為 33.33%和 36.67%。從以上結果可知, 飼料中聯合添加葉酸和 VB12, 可以有效地提高幼蟹抵抗嗜水氣單胞菌感染的能力。

表2 飼料中葉酸和VB12聯合添加對中華絨螯蟹幼蟹增重率、特定生長率、飼料效率和存活率的影響Tab. 2 The effects of combined dietary folic acid and vitamin B12on the weight gain (WG), special growth rate (SGR), feed efficiency (FE) and survival of juvenile Chinese mitten crab Eriocheir sinensis

表3 飼料中葉酸和VB12聯合添加對中華絨螯蟹幼蟹體生化成分的影響(濕重基礎, g)Tab. 3 The effects of combined dietary folic acid and vitamin B12on the body composition of Chinese mitten crab Eriocheir sinensis (wet weight basis, g)

表4 飼料中葉酸和VB12聯合添加對中華絨螯蟹幼蟹酚氧化酶(PO)、溶菌酶(LZM)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)和血細胞總數(THC)的影響Tab. 4 The effects of combined dietary folic acid and vitamin B12on the activities of phenoloxidase, lysozyme, acid phosphatase, alkaline phosphatase, and on the total hemocyte count of Chinese mitten crab Eriocheir sinensis

表 5 飼料中葉酸和 VB12聯合添加對中華絨螯蟹幼蟹超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量的影響Tab. 5 The effects of combined dietary folic acid and vitamin B12on the activity of superoxide dismutase and the level of malondialdehyde in the hepatopancreas of Chinese mitten crab Eriocheir sinensis

圖 1 飼料中葉酸和 VB12聯合添加對中華絨螯蟹幼蟹感染嗜水氣單胞菌后累積死亡率的影響Fig. 1 The effects of combined dietary folic acid and vitamin B12on the cumulative mortality of Chinese mitten crab Eriocheir sinensis after infection with Aeromonas hydrophila

3 討論

本研究發現, 飼料中單一添加葉酸或VB12均可有效提高幼蟹的生長性能和存活率, 當兩者聯合添加時, 對動物的生長性能和存活率的影響則更明顯,而飼料中葉酸和VB12均不補充時, 幼蟹則表現為生長緩慢, 飼料轉化率低下, 對病菌的易感性提高,累計死亡率則明顯高于單一添加葉酸、VB12和聯合添加處理組。以上結果與對南亞野鯪(Labeo rohita Ham)[14]和斑節對蝦(P. mondon)[12]的研究是一致的,提示飼料中合理補充葉酸和 VB12除了有助于促進幼蟹的生長, 提高飼料效率外, 同時對增強機體的免疫性能和抗病力也是有益的。

葉酸和 VB12均是血細胞正常分裂和增值所必需的[2, 3, 7]。由于葉酸和VB12均與蛋氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的合成有關[23], 并且在 DNA的代謝中起到重要作用[24]。所以, 當 VB12缺乏或不足時, S-腺苷甲硫氨酸合成減少, 且5,10-亞甲基四氫葉酸轉化為5-甲基四氫葉酸的過程受阻, 從而導致DNA受損和血細胞不能正常成熟和發育, 最終會導致巨幼紅細胞貧血[25]。John和 Mahajan[14]研究發現, 用同時缺乏葉酸和 VB12的飼料投喂南亞野鯪(L. rohita Ham)幼魚, 幼魚會表現出比單一缺乏組更為嚴重的貧血癥狀。Christian和 Greger[26]報道, 合理添加葉酸可以緩解由VB12缺乏引起的貧血。Shiau和Lung[2]的研究表明, 與其他實驗組相比, 投喂同時缺乏葉酸和VB12的斑節對蝦生長性能最差, 從而推斷添加葉酸和VB12對斑節對蝦(P. mondon)的正常生長、生理代謝具有協同作用。在本實驗中, 投喂聯合處理組飼料幼蟹的血淋巴細胞密度最大, 其次是單一添加葉酸組和單一添加VB12組, 而對照組最低。同時,可用來反映水生動物健康的指標如酚氧化酶、溶菌酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶等, 也表現出與血淋巴細胞密度類似的變化趨勢。提示合理添加葉酸和VB12對中華絨螯蟹的正常生長、生理代謝和免疫性能的提高, 均可能有協同和互補的作用。

然而, 有關葉酸和VB12在生理代謝中的關系也存在一定的爭議。其中, Castle等[27]的報道中提到,早期有學者假定, 在VB12的生理代謝利用過程中涉及一種內因子(葉酸或蝶酰谷氨酸聚合物)和外因子(一種糖蛋白), 而研究證明, 這個內因子可能是葉酸或者是蝶酰谷氨酸的異構體。Herbert和Zalunsky[28]報道, 通過對葉酸和 VB12生物化學相互關系的大量研究, 得出了甲基四氫葉酸陷阱(Methyl tetrahydrofolate trap)的假說。該假說認為, 當 VB12缺乏時, 同型半胱氨酸轉化為蛋氨酸的過程受阻,使甲基四氫葉酸不能形成四氫葉酸[29], 這一假設得到了一些學者的認同。此外, Weissbach和Taylor[30]研究認為, VB12可以通過轉甲基酶調節葉酸的代謝。本研究的結果表明, 葉酸和 VB12對中華絨螯蟹(E. sinensis)幼蟹的生長、非特異性免疫力和抗病力均有協同作用。但是, 有關葉酸和 VB12在水生動物生理代謝中的作用過程和可能機制, 包括是否存在“甲基四氫葉酸陷阱”現象等, 還需要進一步探討和研究。

4 結論

中華絨螯蟹(E. sinensis)幼蟹攝食缺

乏葉酸和

VB12的飼料會表現出生長緩慢、飼料轉化效率低、死亡率高和易感染致病菌等癥狀, 單一補充葉酸或

VB12可以改善幼蟹的生長性能, 提高免疫性能和抗病力, 而同時補充適量的葉酸和 VB12則效果更明顯。實驗結果提示, 葉酸和VB12在幼蟹的生長和生理代謝中具有協同作用, 建議在幼蟹人工飼料中適量補充葉酸(2.3 mg/kg)和VB12(0.2 mg/kg)。

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THE EFFECTS OF DIETARY FOLIC ACID AND VITAMIN B12ON THE GROWTH PERFORMANCE, NON-SPECIFIC IMMUNITY AND THE DISEASE RESISTANCE OF
JUVENILE CHINESE MITTEN CRAB ERIOCHEIR SINENSIS

WEI Jian-Jun1, ZHANG Fan1, TIAN Wen-Jing1, LI Er-Chao1, WU Qiang-Qiang2and CHEN Li-Qiao1
(1. College of Life Science, East China Normal University, Shanghai 200241, China; 2. Tongwei Company Limited, Chengdu 610041, China)

In this study, we aimed to determine the combined effects of dietary folic acid and vitamin B12on the growth, non-specific immunity, and the disease resistance of juvenile Chinese mitten crab Ericheir sinensis. The crabs [initial weight, (2.57 ± 0.02) g] were fed with 4 experimental diets containing 2 concentrations of folic acid (0 and 2.3 mg folic acid/kg diet) and vitamin B12(0 and 0.2 mg vitamin B12/kg diet). Each diet group had 5 replicates and was fed for 8 weeks. This was followed by an Aeromonas hydrophila challenge for 2 weeks. E. sinensis fed with 2.3 mg folic acid/kg and 0.2 mg vitamin B12/kg showed significantly higher weight gain, specific growth rate, feed efficiency and survival rate than those fed without folic acid and vitamin B12supplementation. The activity of phenoloxidase was the maximum in juveniles fed with 2.3 mg folic acid/kg and 0.2 mg vitamin B12/kg. Juveniles fed with both folic acid and vitamin B12supplementation had the highest levels of total haemocyte count, lysozyme, and activities of acid phosphatase and alkaline phosphatase, followed by crabs fed with either folic acid or vitamin B12only, and the group without folic acid or vitamin B12supplementation was the lowest. Crabs fed with 2.3 mg folic acid/kg and 0.2 mg vitamin B12/kg exhibited the highest activity of superoxide dismutase but the lowest level of malondialdehyde and the cumulative mortality. These results indicated that folic acid and vitamin B12had an interactive effect on the growth, non-specific immunity and the disease resistance of juvenile E. sinensis. The optimal concentrations of dietary folic acid and vitamin B12should be 2.3 mg/kg diet and 0.2 mg/kg diet respectively.

Eriocheir sinensis; Folic acid; Vitamin B12; Growth performance; Non-specific immunity; Aeromonas hydrophila

Q142

A

1000-3207(2015)06-01069-07

10.7541/2015.141

2014-10-30;

2015-03-02

公益性行業(農業)科研專項(No.201003020, 201203065); “十二五”國家科技支撐計劃課題(2012BAD25B00); 國家自然科學基金項目(No.31172422); 上海市中華絨螯蟹現代農業產業技術體系建設和通威股份有限公司科技創新基金部分資助

魏建軍(1988—), 男, 山東臨朐人; 碩士研究生; 主要從事水生動物營養研究。E-mail: weijianjunhao@126.com

陳立僑(1962—), 男, 教授, 博士生導師; 主要從事水生動物營養學、水生動物種質遺傳學和水生生物學研究。E-mail: lqchen@bio.ecnu.edu.cn