黃連溫膽湯改善2型糖尿病大鼠糖脂代謝紊亂*

李月碧，李瑞鵬，趙 迪，楊 京，張衛華，劉 舟，劉華東，馬世平**

1中國藥科大學中藥藥理學教研室，南京 211198；2南京中醫藥大學，南京 210046

黃連溫膽湯改善2型糖尿病大鼠糖脂代謝紊亂*

李月碧1，李瑞鵬1，趙 迪1，楊 京1，張衛華2**，劉 舟2，劉華東2，馬世平1**

1中國藥科大學中藥藥理學教研室，南京 211198；2南京中醫藥大學，南京 210046

目的：考察黃連溫膽湯改善2型糖尿病引起的大鼠糖脂代謝紊亂作用。方法：通過60天高糖高脂飼料喂養合并一次性35 mg·kg-1鏈脲佐霉素（STZ）腹腔注射制備2型糖尿病大鼠模型，測定血糖，篩選模型成功大鼠。將該大鼠分為空白組、模型組、二甲雙胍組（0.2 g·kg-1）和黃連溫膽湯3、6、12 g·kg-1三個劑量組，連續給藥30天。測定血清中空腹血糖（FBG）、血清胰島素（FINS）、糖化血紅蛋白（GHB）、胰島素敏感系數（ISI）、胰島素抵抗系數（IRI）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（CHO）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）和高密度脂蛋白膽固醇（HDLC），評估黃連溫膽湯對大鼠糖脂代謝紊亂的調節作用。HE染色后觀察胰腺病變。結果：黃連溫膽湯能降低FBG、GHB，增加ISI，降低IRI；降低血清TG、CHO和LDLC含量，升高HDLC含量；但對FINS作用不明顯。此外，黃連溫膽湯與模型組相比減輕了胰腺細胞變性，改善胰島病變。結論：黃連溫膽湯可以有效地改善2型糖尿病引起的糖脂代謝紊亂，保護胰腺細胞，其作用機制可能與改善胰島素敏感性和胰島素抵抗有關。

代謝紊亂；糖尿??；胰島素抵抗

糖尿病是近年來的一類高發疾病，主要分為1型和2型。其中以2型糖尿病（T2DM）患者為主，占糖尿病總體人數的90%以上。2009年第20屆國際糖尿病聯盟（IDF）會議中指出，目前世界上已有近3億T2DM患者，如不立即采取行動，到2030年T2DM患者將達4.4億。T2DM是一類主要以糖脂代謝紊亂為主要特征[1]的疾病，能引起多種并發癥的發生[2]。有資料表明，糖脂代謝紊亂是導致糖尿病并發癥的重要原因[3]，因此糖脂代謝紊亂的改善可能對糖尿病及其并發癥的治療有重要意義。

黃連溫膽湯出自《六因條辨》，由黃連、竹茹、半夏、陳皮、枳實、茯苓、甘草、生姜8味藥材組成，具有清熱化痰、理氣和中等功效；現代臨床研究發現它對T2DM具有潛在的治療作用[4]。本實驗主要針對其改善糖脂代謝紊亂的作用進行研究，為糖尿病及其并發癥的治療提供依據。

1 材 料

1.1 藥材與試劑

黃連（Coptis chinensis）、竹茹（Caulis Bambusae in Taeniam）、半夏 （Pinellia ternata Breit.）、陳皮（Pericarpium Citri Reticulatae）、枳實（Citrus aurantium L.）、茯苓 （Wolfiporia cocos）、甘草（Glycyrrhizae）、生姜（Zingiber officinale Roscoe）均購自先聲再康藥店，由中藥資源學教研室秦民堅教授鑒定確認。

葡萄糖（FBG批號：20131006147），糖化血紅蛋白（GHB，批號：20140228），甘油三酯（TG，批號：20140115），總膽固醇（CHO，批號：20140115），低密度脂蛋白膽固醇（LDLC，批號：20130722），高密度脂蛋白膽固醇（HDLC，批號：20130717）測試試劑盒，胰島素Elisa試劑盒（USA）均購自南京建成生物有限公司。

STZ購自sigma公司，用檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液（pH=4.4）配制成10 mg·mL-1的溶液，避光保存，現配現用。

1.2 儀器

酶標儀（Thermo，美國）；低溫離心機（Kubota，日本）；722紫外分光光度計 （上海菁華科技儀器有限公司）；HH-4數顯恒溫水浴鍋 （常州國華電器有限公司）；BX50型光學顯微鏡 （日本Olympus公司）；RM2235型石蠟切片機（德國Leica公司）；電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）等。

1.3 動物

清潔級雄性SD大鼠90只，購自江蘇大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（蘇）2009-0002，體重180～200 g。動物分籠飼養，12 h晝夜節律，室溫22℃～24℃，自由飲食飲水。

2 方 法

2.1 藥材處理

黃連溫膽湯中各藥物的比例按照清代陸廷珍《六因條辨》原方的比例（黃連∶竹茹∶半夏∶枳實∶陳皮∶茯苓∶甘草∶生姜＝4∶4∶4∶4∶6∶3∶2∶2）。將飲片浸泡30 min，水煎煮兩次，每次煎30 min，用紗布趁熱濾過，60℃恒溫水浴濃縮至1.2 g·mL-1，冷藏備用。

2.2 動物分組與2型糖尿病模型的建立

將大鼠按體重隨機分6組，分為空白組和模型1～5組。除空白組外各組均用高糖、高脂飼料（10%豬油、15%蔗糖、5%蛋黃粉、0.5%膽固醇、0.5%膽酸鹽、69%常規飼料）喂養60天后，腹腔注射STZ 35 mg·kg-1。一周后測定其隨機血糖，篩選隨機血糖值＞13.9 mmol·L-1的大鼠作為模型成功大鼠。將模型成功大鼠60只按血糖值隨機分為模型組、二甲雙胍組（0.2 g kg-1）、黃連溫膽湯低、中、高三個劑量組（生藥材量3、6、12 g·kg-1）6組，每組10只，并于每日9～11時進行一次灌胃給藥，連續給藥30天。

2.3 血液樣本和組織樣本的收集

給藥結束后，禁食12h，各組大鼠眼眶取血2mL。靜置后，3500 r·min-14℃離心10 min，吸取上層血清，保存于-20℃備用。之后每組留3只大鼠，其余大鼠麻醉并處死，再斷頭取血約4 mL置于已加入0.5 mL 15%的EDTA Na抗凝溶液中，上下顛倒混勻。靜置30 min后，1000 r·min-1離心10 min（4℃），棄上清液，洗滌2～3次后，取沉淀，即血細胞。取血細胞1 mL加雙蒸水1.5 mL，用手激烈振搖數分鐘后，制得溶血液，保存在-20℃備用。

將每組留取的3只大鼠麻醉后，進行心室灌注100 mL PBS和150 mL 4%多聚甲醛，取出大鼠胰腺，置于10%福爾馬林溶液中固定，備用。

2.4 生化指標的測定

從-20℃取出血清，待樣本解凍后，按試劑盒說明書要求測定FBG、TG、CHO、LDLC、HDLC含量，ELISA法測定FINS含量。并按照Haffner等[5]在Homa模型中的方法測IRI和ISI：

胰島素抵抗系數的計算式：IRI=FBG×FINS/ 22.5；

胰島素敏感指數[6]：ISI=-Ln（FBG×FINS）。

2.5 GHB的測定

從-20℃取出血溶血液，解凍后用試劑盒說明書進行酸化、水解、顯色等步驟，并測定溶血液中血紅蛋白含量，最后計算每10 g血紅蛋白中糖化血紅蛋白的吸光度值。

2.6 胰腺的藥理學檢測

取出福爾馬林溶液中的大鼠胰腺，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，進行石蠟包埋。之后在石蠟切片機上切片，進行HE染色，在光學顯微鏡下觀察胰腺和胰島結構的病變。

2.7 統計學處理

3 結 果

3.1 黃連溫膽湯對糖尿病大鼠糖代謝紊亂的影響

實驗結果表明，糖尿病模型組大鼠與空白組相比FBG和GHB明顯升高，FINS變化不明顯，ISI降低，IRI升高（P＜0.05或P＜0.01）。黃連溫膽湯各劑量組和二甲雙胍組能明顯增高ISI，降低IRI，抑制FBG和GHB含量的升高（P＜0.05或P＜0.01），但對FINS的改變不明顯，結果見表1。

3.2 黃連溫膽湯對糖尿病大鼠脂質代謝紊亂的影響

實驗結果表明，糖尿病模型組大鼠與空白組相比TG、CHO和LDLC含量升高，HDLC含量降低（P＜0.05或P＜0.01）。黃連溫膽湯各劑量組和二甲雙胍組能明顯增加HDLC含量，抑制TG、CHO和LDLC的含量升高（P＜0.05或P＜0.01），見表2。

3.3 黃連溫膽湯對胰腺病變的影響

圖1中空白組大鼠胰腺呈分葉狀，內、外分泌部之胰島細胞和腺泡上皮無變性、壞死，間質血管無充血及炎細胞浸潤；而糖尿病模型組大鼠和空白組相比胰島的結構發生明顯改變，細胞數目減少且重度變性及壞死，部分導管空泡變性；而二甲雙胍組和黃連溫膽湯各劑量組胰島的結構較模型組清晰，細胞變性減輕，導管空泡變性也有所減輕。

表1 黃連溫膽湯對糖尿病大鼠糖代謝紊亂的影響（±s，n=10）

表1 黃連溫膽湯對糖尿病大鼠糖代謝紊亂的影響（±s，n=10）

注：“##”表明與空白組相比P<0.01，統計學有極顯著差異，“#”表明與空白組相比P<0.05，統計學有顯著性差異；同樣“**”表明與模型組相比P< 0.01，統計學有極顯著差異，“*”表明與模型組相比P<0.05，統計學有顯著性差異。

組別劑量（g·kg-1）FBG（mmol·L-1）FINS（mU·L-1）IRI ISI GHB（吸光度/10 g蛋白）空白—4.54±0.39 12.03±1.58 2.37±0.37 -3.97±0.16 20.08±9.17模型—25.2±7.16##10.83±1.23 13.97±6.03##-5.67±0.46##46.38±10.10##二甲雙胍0.2 11.13±5.50**9.21±5.31 3.11±1.98**-4.40±0.91*19.67±6.58**黃連溫膽湯（低）3 13.65±6.42*9.54±2.25 5.14±1.85*-4.89±0.54*31.67±6.81*黃連溫膽湯（中）6 11.98±5.26*8.75±2.62 4.93±2.88**-4.54±0.63**30.32±3.94*黃連溫膽湯（高）12 11.43±5.32**9.22±1.24 4.60±1.91**-4.54±0.53**26.06±10.45*

表2 黃連溫膽湯對糖尿病大鼠脂質代謝紊亂的影響（±s，n=10）

表2 黃連溫膽湯對糖尿病大鼠脂質代謝紊亂的影響（±s，n=10）

注：“##”表明與空白組相比P<0.01，統計學有極顯著差異，“#”表明與空白組相比P<0.05，統計學有顯著性差異；同樣“**”表明與模型組相比P<0.01，統計學有極顯著差異，“*”表明與模型組相比P<0.05，統計學有顯著性差異。

組別劑量（g·kg-1）LDLC（mmol·L-1）HDLC（mmol·L-1）TG（mmol·L-1）CHO（mmol·L-1）空白—0.77±0.13 0.74±0.18 0.73±0.18 1.40±0.12模型—4.99±1.81##0.48±0.11#3.71±0.57##9.22±1.49##二甲雙胍0.2 1.08±0.16**0.80±0.19*0.80±0.23**3.50±0.79**黃連溫膽湯（低）3 1.35±0.55**0.72±0.19*2.24±0.75**6.10±1.57**黃連溫膽湯（中）6 1.12±0.46**0.85±0.26*2.15±0.42**5.56±1.06**黃連溫膽湯（高）12 0.97±0.30**1.33±0.47**1.94±0.57**5.26±0.91**

圖1 黃連溫膽湯對胰腺病變的影響

4 討 論

T2DM是現代人類常見病多發病，目前普遍認為T2DM的發病，是遺傳和環境因素所致的綜合結果。胰腺是胰島聚集部位，分泌胰島素從而調節糖脂代謝。胰島細胞根據分泌功能不同分為胰島A細胞和B細胞，其中胰島B細胞是胰島素的主要分泌細胞。STZ是一種選擇性破壞胰腺B細胞的毒性物質，是目前制備糖尿病模型的常用試劑之一[7]。而體內過多的糖和脂質攝入引起的糖毒性和脂毒性是加劇胰島B細胞損傷甚至凋亡的主要原因[8-9]。本文采用長期的高糖高脂飲食配合小劑量STZ腹腔注射制備糖尿病大鼠模型。在胰腺的病理切片中，能明顯地觀察到模型組大鼠的胰腺中胰島結構不清，細胞重度變性，血管空泡變性等現象，這表明模型建立成功，糖尿病導致了大鼠胰島功能受損，而黃連溫膽湯給藥組對這一病變有一定的改善作用。

胰島素是調節糖脂代謝的重要激素[10]，由胰腺B細胞分泌入血，分布到全身各處，與各處胰島素受體結合，激活胰島素信號通路，從而調節全身各處的糖脂代謝等。胰島素抵抗指正常的胰島素無法引起胰島素的正常生理應答，即胰島素敏感性降低。ISI和IRI是近年來人們評估胰島素敏感性和胰島素抵抗的兩項重要指標。在本實驗中T2DM模型組大鼠血清中胰島素含量與正常大鼠相比無明顯變化，但ISI降低，IRI升高；這提示糖尿病中胰島素的分泌并沒有出現很大變化，但胰島素敏感性降低，發生了胰島素抵抗。實驗結果顯示，二甲雙胍組和黃連溫膽湯各劑量組與模型組的相比能明顯升高ISI，降低IRI，升高的血糖血脂指標也相應的有所降低。因此可以推測二甲雙胍和黃連溫膽湯可能是通過改善了胰島素敏感性，改善胰島素抵抗，從而改善了糖脂代謝紊亂的狀況。

綜上所述，黃連溫膽湯能有效地改善2型糖尿病大鼠體內的代謝紊亂狀況，其作用機制可能與改善胰島素敏感性和胰島素抵抗有關。

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Protective Effect of Huanglian Wendan Decoction on Metabolism Disorder in a Rat Model of Type 2 Diabetic Mellitus

LI Yue-bi1,LI Rui-peng1,ZHAO Di1,YANG Jing1,ZHANG Wei-hua2**,LIU Zhou2,LIU Hua-dong2,MA Shi-ping1**1China Medicine University Chinese Medicine Pharmacology,Nanjing 211198;2Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210046

Objective:The aim of this study is to investigate the therapeutical effect of Huanglian Wendan decoction on metabolism disorder in a rat model of type 2 diabetic mellitus.Methods:60 days high-glucose-high-fat diet and 35 mg·kg-1streptozocin(STZ)injection once were used to bulid a rat model of type 2 diabetic mellitus.Following,metformin hydrochloride(0.2 g·kg-1),berberine hydrochloride(0.2 g· kg-1),HLWDD(3,6,12 g·kg-1)were given by gavage for 30 days except normal and model groups after randomly divided into six groups.Relate measurements about glucose and lipid metabolism in serum were did,and insulin sensitivity index (ISI)and insulin resistance index (IRI)were calculated to evaluate the improvement of Huanglian Wendan decoction on metabolism disorder.The pathological damage of pancreas was observed by a HE staining.Results:30 days administration of Huanglian Wendan decoction to the rats reduced fast blood glucose(FBG),glycosylated hemoglobin(GHB),IRI,triglyceride(TG),total cholesterol (CHO)and low density lipoprotein cholesterol (LDLC)in serum;increased ISI and high density lipoprotein cholesterol (HDLC).However,its effect to FINS can not significantly observed.Treatment of HLWDD to rats also protected them from pathological damage of pancreas.Conclusion:Treatment of Huanglian Wendan decoction protects rats from metabolism disorder and pathological damage of pancreas in a rat model of type 2 diabetic mellitus significantly.Its mechanism may related to the improvement on insulin sensitivity and insulin resistance.

Metabolism disorder;Diabetic mellitus;Insulin resistance

R965.1

A

1673-7806（2015）01-001-04

教育部博士點基金（20113237120007）；江蘇省中醫藥局科技項目（LZ13001）；江蘇省高校自然科學研究計劃（12KJD360002）

李月碧，女，碩士研究生，研究方向：中藥及復方藥理研究 E-mail:liyuebi19900920@163.com

* *通訊作者馬世平，男，博士研究生導師，研究方向：中藥及復方藥理研究 E-mail:spma@cpu.edu.cn；張衛華，男，講師，博士，研究方向：治法與方劑配伍的理論與實驗研究 E-mail:zwhtcm@sina.com

2014-10-15

2014-10-29