穩轉GFP-RAB7的腎小管上皮細胞在缺氧狀態下RAB7的表達及位置變化

余文敏，張曉毅，王智，陳平圣，竇駿

(東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009)

·論 著·

穩轉GFP-RAB7的腎小管上皮細胞在缺氧狀態下RAB7的表達及位置變化

余文敏，張曉毅，王智，陳平圣，竇駿

(東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009)

目的：了解缺氧狀態下RAB7蛋白在穩轉GFP-RAB7表達載體的腎小管上皮細胞中的表達及位置變化，驗證其對細胞自噬與內吞現象的指示作用。方法：構建GFP-RAB7表達融合蛋白慢病毒載體轉染腎小管上皮細胞(HK-2)，缺氧處理后，采用RT-qPCR、蛋白質印跡技術和激光共聚焦技術檢測外源基因RAB7在細胞內的表達及位置的變化。結果：成功將GFP-RAB7基因的表達載體轉染到HK-2細胞中，并獲得穩定表達GFP-RAB7蛋白的HK-2細胞；在缺氧狀態下，RAB7 mRNA的表達輕微降低，蛋白水平沒有變化；激光共聚焦顯微鏡發現GFP-RAB7蛋白發生聚集，顯示自噬與內吞的形成。結論：成功建立穩定轉染的表達GFP-RAB7的HK-2細胞系，GFP-RAB7融合蛋白可指示自噬與內吞現象，為研究缺氧狀況下腎小管上皮細胞自噬與內吞提供了有效工具。

缺氧； GFP-RAB7蛋白； 腎小管上皮細胞； 自噬； 內吞

2000年Fine等[1]提出慢性缺氧假說，強調腎小管間質的慢性缺血損傷是各種腎臟病發展為終末期腎病的共同通路。研究表明，腎小管上皮細胞對缺氧十分敏感，易因此而損傷并釋放炎癥介質，促進疾病的發展，但具體機制尚未完全搞清[2-3]。

自噬(autophagy)是一種細胞代謝方式，細胞將自身的胞質蛋白和細胞器以形成自噬泡的形式由溶酶體降解，以清除細胞內衰老損傷的細胞器、聚集的變性蛋白和循環再利用氨基酸等。內吞作用(endocytosis)是細胞質膜內陷將細胞外物質轉入細胞內的過程。研究顯示，缺氧促進細胞自噬和內吞[4]，因此若要揭示慢性腎臟病進展機制，小管上皮細胞自噬和內吞是極為重要的研究領域。盡管檢測自噬和內吞的方法較多，但既簡便又能動態觀察的方法甚少。RAB7存在于自噬體和晚期內吞體膜上，是自噬體和內吞體成熟所必需的共享分子之一[5]。

本實驗通過構建和轉染慢病毒表達載體，使腎小管上皮細胞表達綠色熒光蛋白(GFP)和RAB7的融合綠色熒光蛋白；并在體外模擬缺氧狀態下，觀察GFP和RAB7融合綠色熒光蛋白中的表達及位置變化，為了解腎小管上皮細胞在缺氧狀態下發生自噬和內吞的程度提供一種簡單、直觀的研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料

HK-2細胞系購自中科院上海細胞資源庫，GFP-RAB7慢病毒過表達載體委托上海吉瑪生物公司構建，G418、RIPA蛋白裂解液、丙烯酰胺、化學發光液、BCA蛋白定量試劑盒和熒光定量試劑盒購自諾唯贊生物公司，PVDF膜購自Millipore公司，RAB7抗體購自Abcam公司，HRP標記羊抗兔二抗購自Protech公司，引物由上海桑尼生物公司合成。

1.2 HK-2細胞的培養及轉染

1.2.1細胞培養 將HK-2細胞接種于6孔板，細胞密度以確保第2天每孔能達到80%為宜，采用DMEM+10% FBS培養基(無雙抗)，置于培養箱中，體積分數5% CO2、37 ℃、飽和濕度下培養。

1.2.2細胞轉染及鑒定 按照上海吉瑪生物公司提供的說明書進行轉染，以終濃度為500 ng·ml-1的G418篩選穩轉株。熒光顯微鏡下觀察經DAPI染色的細胞表達綠色熒光蛋白情況，適時熒光定量PCR檢測RAB7 mRNA表達水平(具體方法見下述)。

1.2.3實驗分組 穩轉GFP-RAB7的HK-2細胞分為常氧組和缺氧組。常氧組為正常氧氣濃度(O2體積分數21%)的培養條件，體積分數5% CO2、37 ℃培養24 h；缺氧組在CO2/N2/O2體積分數為5%/94%/1%的培養箱培養24 h。分別重復3次。

1.3 RNA提取與適時熒光定量PCR

參照Invitrogen公司的RNA提取試劑盒說明書；反轉錄采用諾唯贊公司提供說明書。適時熒光定量PCR以GAPDH基因為內參，采用諾唯贊公司的SYBRGreenI嵌合熒光法定量試劑盒，用2-△△t定量法分析數據結果。引物序列為：RAB7基因上游引物5′-CATCCTGGGAGATTCTGGAGTC-3′，下游引物5′-TGTGTCCCATATCTGCATTGTG-3′(產物156 bp)；GAPDH基因：上游引物AAGGTGAAGGTCGGAGTC，下游引物GAAGATGGTGATGGGATTTC(產物150 bp)。

1.4 蛋白提取與蛋白質印跡

收集各組細胞，RIPA蛋白裂解液溶解細胞，以14 000×g、4 ℃離心15 min。將蛋白定量后，取40 μg總蛋白經12%SDS-PAGE凝膠分離，4 ℃恒壓轉移至PVDF膜上，3% BSA封閉1 h，TBST洗膜5 min，3次。加入RAB7抗體(1∶1 000稀釋)。TBST洗膜5 min，3次，再用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔(1∶3 000稀釋)孵育1 h，TBS洗膜5 min，3次。ECL顯色。以GAPDH抗體(1∶3 000稀釋)作為對照。

1.5 激光共聚焦顯微鏡(LSCM)掃描

穩轉GFP-RAB7的細胞鋪滿孔底80%左右傾去完全培養基，PBS沖洗3遍后加入無血清低糖DMEM。細胞放入培養箱中低氧培養，條件同上，培養24 h后PBS沖洗3遍，用預冷的多聚甲醛固定30 min。在LSCM(奧林巴斯FV1000，日本)下觀察并拍攝GFP-RAB7的表達和位置變化情況。

1.6 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件包(SPSS Inc，美國)分析數據。數據以均數±標準差表示。組間差異分析用t檢驗。P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 穩轉GFP-RAB7的HK-2細胞鑒定

熒光顯微鏡下，穩轉GFP-RAB7的HK-2細胞漿內可見高強度翠綠色熒光(圖1)，用DAPI染核顯示，RAB7蛋白位于細胞質中，表明轉染效率為100%及RAB7的表達位置正確。適時熒光定量PCR檢測顯示穩轉細胞RAB7 mRNA表達水平顯著高于未轉染細胞。轉染RAB7蛋白的HK-2細胞在mRNA表達水平是未轉染HK-2細胞的48.0±2.86倍，差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖1 穩轉細胞GFP-RAB7綠色熒光蛋白表達情況 A.細胞核顯示深藍色熒光(DAPI染色，20×10)； B.胞漿呈現翠綠色熒光(20×10)； C.細胞核熒光與胞漿熒光重合圖(20×10)

Fig 1 The expression of stably transfected GFP-RAB7 in HK-2 cellsA.Nuclear staining showed blue fluorescence with DAPI(DAPI staining，20×10); B.The Cytoplasm presented green fluorescence(20×10); C.The merge of nucleus fluorescence and green fluorescence in cytoplasm(20×10)

2.2 缺氧狀態下GFP-RAB7的位置變化

通過LSCM在高倍視野下觀察發現，常氧組細胞GFP-RAB7熒光顆粒散在分布于細胞質中，無聚集發生；缺氧之后細胞自噬與內吞增強，RAB7蛋白在細胞質中熒光顆粒明顯聚集，顯示細胞自噬與內吞的發生，并有靠近細胞核周圍的趨勢(圖2)。常氧組細胞GFP-RAB7熒光顆粒散在分布于細胞質中；缺氧組細胞質中熒光顆粒聚集，主要分布在細胞核周圍。

圖2 缺氧狀態下GFP-RAB7熒光顆粒位置變化(LSCM)

Fig 2 The position change of GFP-RAB7 green fluorescent protein in HK-2 cells under hypoxia(LSCM)

2.3 缺氧狀態下GFP-RAB7穩轉細胞的RAB7 mRNA表達情況

缺氧狀態下，穩轉GFP-RAB7的HK-2細胞的RAB7蛋白盡管位置發生變化，RAB7的mRNA水平的表達有所減少，常氧組的表達量為1.0±0.32，缺氧組為0.8±0.06，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 缺氧狀態下GFP-RAB7穩轉細胞的RAB7蛋白的表達情況

蛋白質印跡檢測顯示，缺氧和常氧狀態下GFP-RAB7的HK-2細胞中RAB7蛋白的表達沒有變化(圖3)。

圖3 缺氧和常氧狀態下GFP-RAB7穩轉細胞RAB7蛋白表達和比較 A.RAB7蛋白表達； B.RAB7蛋白表達比較； 1、2.常氧； 3、4.缺氧

Fig 3 The expression and comparison of RAB7 in HK-2 cell with GFP-RAB7 protein in normoxia and hypoxiaA.The expression of RAB7 protein; B.The comparison of RAB7 protein； 1，2.normoxia； 3，4.hypoxia

3 討 論

在慢性腎臟病，腎小管周圍微血管往往呈進行性缺失，引起或加重腎間質缺氧，并且缺氧刺激下的血管新生反應又明顯不足，最終使纖維化呈進行性發展。研究顯示腎近端小管細胞可能是缺氧損傷的主要目標[6]；損傷的腎小管上皮細胞釋放多種炎癥介質參與纖維化的發展[7]。因此，研究缺氧情況下腎小管上皮細胞的代謝及功能變化，對于了解腎臟纖維化形成機制大有裨益。自噬和內吞是細胞進化上極為保守的代謝方式，缺氧狀況下，細胞自噬、內吞活躍，且常相伴發生，闡釋其變化程度與細胞功能狀態的關系無疑是十分重要的。

透射電子顯微鏡仍然是檢測自噬和內吞現象的金標準，但樣品制作繁瑣，設備昂貴，有時清晰度欠佳，最欠缺之處是不能動態觀察。有研究顯示，利用GFP-LC3融合蛋白特異性定位自噬泡，通過觀察細胞內熒光顆粒的量及分布情況，可以實時監測細胞自噬的進程，現已成為研究細胞自噬的重要方法[6，8-9]。但是GFP-LC3的融合蛋白僅能顯示自噬程度，不能反映內吞程度，也就無法全面顯示細胞的自噬與內吞的水平。

Rab7存在于自噬體和晚內吞體膜上，是自噬體和內吞體成熟所必需的共享分子之一，屬小GTP酶，能導引胞內貨物沿微管運輸，最后參與自噬體和內吞體與溶酶體的融合過程，目前認為該分子是調控自噬和內吞的關鍵分子[5]。

本研究將GFP-RAB7慢病毒表達載體轉染人的腎小管上皮細胞系，通過觀察細胞內熒光強度和RAB7基因表達，證實穩定轉染細胞株構建成功。經缺氧處理后，穩定轉染GFP-RAB7的細胞中出現大量綠色熒光顆粒聚集于細胞核附近，有別于非缺氧細胞的熒光顆粒分布，結合其他作者相關報道[6]，我們認為該現象提示GFP-RAB7熒光融合蛋白能反映細胞自噬與內吞活動。但是在缺氧狀態下，該穩轉細胞株并未出現RAB7表達量的明顯變化，說明缺氧可能不影響RAB7的基因活動，只影響其在細胞內的分布，進一步說明慢病毒融合蛋白指示自噬與內吞現象的特異性。由于穩轉細胞株能傳代培養，這就為后續研究HK-2細胞自噬與內吞提供了有效工具，同時也可以作為反映細胞缺氧程度的候選分子標記。

綜上，本實驗成功構建了穩轉GFP-RAB7表達載體的腎小管上皮細胞系，使缺氧狀態下細胞自噬和內吞程度得以實時監測，為深入研究慢性腎臟病的發生發展機制提供了便利，但仍需進一步觀察轉染細胞形態學特點、生物學行為以及功能變化，以便為推廣應用打下堅實基礎。

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Changes of expression and location of RAB7 in HK-2 cells stably transfected GFP-RAB7 protein under hypoxia

YU Wen-min，ZHANG Xiao-yi，WANG Zhi，CHEN Ping-sheng，DOU Jun

(SchoolofMedicine,SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective: To establish the HK-2 cell line (human proximal tubular cells) stably transfected an expressing vector of human GFP-RAB7 fused protein，and detect its indicative function of autophagy and endocytosis under hypoxia. Methods: Lentiviral expression vector of human GFP-RAB7 fused protein was constructed， and then stably transfected to HK-2 cell line. The expression and location of GFP-RAB7 were detected by RT-qPCR， Western blot and laser scanning confocal microscope(LSCM). Results: The HK-2 cells transfected the vector stably expressed GFP-RAB7 fused protein. These results indicated that the level of RAB7 mRNA was decreased under hypoxic conditions， while hypoxia did not affect the expression of total amount of RAB7 protein. The result of LSCM showed the aggregation of GFP-RAB7 and formation of autophagosome in transfected HK-2 cells under hypoxia. Conclusion: We have successfully constructed a stable transfected HK-2 cell line which expresses GFP-RAB7 protein. The fuse protein could be a good indicator for autophagy and endocytosis. It may provide a simple and effective method for studying autophagy and endocytosis in cells.

hypoxia; GFP-RAB7 protein; proximal tubular cell; autophagy; endocytosis

2015-06-29

2015-07-11

國家自然科學基金資助項目(81370868)；中央高?；究蒲袠I務費專項資金項目；江蘇省普通高校研究生科研創新計劃項目(KYLX_0197)

余文敏(1978-)，男，江西九江人，在讀博士研究生。E-mail:yuwenmin2013@126.com

陳平圣 E-mail：chenpsh@sina.com 竇駿 E-mail:njdoujun@seu.edu.cn

余文敏，張曉毅，王智，等.穩轉GFP-RAB7的腎小管上皮細胞在缺氧狀態下RAB7的表達及位置變化[J].東南大學學報：醫學版，2015，34(5)：710-714．

R361.3； R364.4

A

1671-6264(2015)05-05-0710-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.006