維吾爾族剝脫綜合征患者LOXL1基因甲基化狀態的研究

唐　艷,付　競,熱西提·沙買提，陳雪藝

(1.新疆醫科大學第一附屬醫院眼科，新疆 烏魯木齊　830054；2.新疆博州人民醫院眼科，

新疆 博樂　833400)

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維吾爾族剝脫綜合征患者LOXL1基因甲基化狀態的研究

唐艷1,付競1,熱西提·沙買提2，陳雪藝1

(1.新疆醫科大學第一附屬醫院眼科，新疆 烏魯木齊830054；2.新疆博州人民醫院眼科，

新疆 博樂833400)

摘要：目的通過檢測新疆維吾爾族剝脫綜合征(exfoliation syndrome，XFS)患者和正常健康人群外周血LOXL1基因甲基化狀態，明確XFS患者外周血中LOXL1基因甲基化狀態改變并參與XFS的發病機制，探討其是否可作為一個分子指標應用于維吾爾族XFS的早期臨床檢測。方法收集2012年3月—2013年5月新疆喀什地區、庫車地區及該院眼科住院治療的維吾爾族XFS患者64例，并選取生活背景、性別、年齡相匹配的正常維吾爾族人群75例健康人作為對照組，應用甲基化特異性聚合酶鏈反應(MS-PCR)的方法對標本進行甲基化檢測，判斷LOXL1基因甲基化水平。結果維吾爾族剝脫綜合征患者LOXL1基因甲基化率為26.6% (17/64)；而維吾爾族正常對照組LOXL1基因甲基化率為12%(9/75)。結論LOXL1基因是維吾爾族剝脫綜合征患者的遺傳易感基因，XFS患者外周血LOXL1基因啟動子區的甲基化水平明顯高于對照組，其甲基化狀態的改變可能與剝脫綜合征的發病相關。

關鍵詞：剝脫綜合征；DNA甲基化；維吾爾族

剝脫綜合征(exfoliation syndrome，XFS)是一種以眼前節組織中灰白色剝脫樣物質異常聚集為特征的原因不明性疾病。Lindberg等[1]于1917年首次在慢性青光眼病例中發現了位于瞳孔部的絮狀物附著的膜性物質,其臨床表現為特征性細小、白屑樣物質在眼前段組織中沉積,以瞳孔緣及晶體前囊膜最常見，前房中也可見碎屑狀漂浮，散大瞳孔后可見到晶體前囊表面沉積物的存在[2]，且呈三區分布,即瞳孔中部透明區、顆粒狀周邊區以及半透明中央區[3]。

目前普遍認為，XFS是一種與年齡相關的全身性細胞外基質代謝異常性疾病，其罹患青光眼、白內障的概率較高，且隨年齡增長而增加[4]。近年來認為剝脫綜合征是開角型青光眼主要原因之一，在世界范圍內的開角型青光眼中占25%[5]。其原因可能與XFS引起小梁網和Schlemm 管壁內皮細胞形成剝脫性物質和小梁網水腫使小梁網間隙變窄， 最終導致房水流出受阻有關。剝脫綜合征性青光眼有比較復雜的臨床表現，重點是要患者預防，及早發現，并及時的給予正確的治療，才能盡量避免并發癥的發生，目前最重要的是防治該病的致盲性[6]。流行病學顯示在世界范圍內所有地域均可發生此病，影響世界范圍10%～20%的60歲以上人群[7]。新疆是一個維吾爾族人群聚居的地方，這為本研究提供了豐富的遺傳基因研究資源。我們的流行病學研究發現XFS在新疆維族人群中發病率較高，我們在庫車縣的流行病學調查中發現，60歲及以上維吾爾族人群XFS的患病率為2.2%，80歲及以上XFS患病率為9.5%，因XFS致盲眼占28.1%[8],提示XFS的發病可能與種族、性別、遺傳等因素有關，它在新疆維吾爾族人群中患病率相對較高。

近年來分子病理學的基質纖維化理論、分子生物學的基因、轉錄子及蛋白質水平研究均支持XFS是一種與應激誘導相關的聯合彈性纖維成分過度生產和異常聚集的彈性組織變性疾病。有關剝脫綜合征與賴氨酰氧化酶樣基因-1(lysyl oxidase-like 1，LOXL1)的關聯研究引起學者們的廣泛興趣。Thorleifsson等[9]首次發現LOXL1基因與剝脫綜合征有較強的關聯性，同時Thorleifsson對594例XFS患者以及14 672例健康對照個體進行基因分型，首次發現了位于15號染色體24位的危險基因LOXL1與XFS的發生存在較強的相關性，且與XFS存在較強的關聯性LOXL1基因有3個的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisrns，SNPs)，即rsl04866l、rs3825942及rs2165241。隨后這一結論在各國學者的研究中得到證實[10-11]。LOXL1基因甲基化狀態與剝脫綜合征的關聯性研究國內外鮮見報道，本研究的研究對象為60歲以上新疆維族XFS患者及正常人群，通過甲基化特異性PCR法檢測維吾爾族XFS患者LOXL1基因的異常甲基化狀態，旨在原有研究的基礎上進一步探討該病的發病機制，為XFS的預防及干預提供科學依據。

1資料與方法

1.1對象收集2012年3月—2013年5月在新疆喀什地區、庫車地區以及新疆醫科大學第一附屬醫院確診為剝脫綜合征的維吾爾族人群作為病例組(XFS組)，共64例；與病例組生活背景、年齡、性別等相匹配并且經嚴格檢查確定無血緣關系的維吾爾族健康人群作為對照組，共75例納入本研究。

所有研究對象均簽署知情同意書，并且歷經詳細的眼科檢查(視力、裂隙燈、眼壓、前房角鏡檢查、視野、間接眼底鏡等)，通過新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會的倫理審查資格。

1.2納入標準及排除標準參照Ritch 等[12]XFS的診斷標準，散瞳看到呈三區分布(半透明的中央圓盤狀區，偶爾伴有卷曲的邊緣；周邊部環形顆粒區，可有放射狀的條帶；二者之間為不含剝脫物質的透明帶)的晶狀體前囊表面剝脫物質的沉積，且視盤和標準自動化視野檢查正常，Goldman扁平角膜壓力計測量IOP 小于21 mmHg。

正常對照組(不含陽性及陰性對照)：(1)沒有異常剝脫物質聚集于眼前段或瞳孔緣；(2)眼壓小于21 mmHg； (3)視野和視盤均正常；(4)無青光眼家族史；(5)與病例組生活背景、年齡、性別相匹配且無血緣關系的維吾爾族健康人群；(6)除了輕微屈光不正外沒有其它眼部疾病史。

病例組及對照組均排除高血壓、糖尿病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病、強烈紅外線接觸史、眼科手術史，各種原因所致的繼發性青光眼(葡萄膜炎、色素上皮綜合征、虹膜角膜內皮綜合征)。排除被選對象拒絕繼續合作者。

1.3方法XFS組和對照組清晨空腹抽取靜脈血約3 mL，2 000 r·min-1離心5 min分離血清，置-80℃冰箱備存。將外周血提取DNA進行甲基化修飾完全后，采用甲基化特異性聚合酶鏈反應法(MS-PCR)擴增目的片段，最后進行瓊脂糖凝膠電泳，分析XFS組和對照組外周血LOXL1基因CpG島甲基化狀態。DNA甲基化修飾試劑盒購自美國Zymo Research公司，所有操作均按照說明書進行。

2結果

2.1基線資料比較將64例維吾爾族XFS患者和75例維吾爾族健康人群納入本研究。XFS組(n=64)，男性40例(62.5%)，女性24例(37.5%),平均年齡為(68.18±9.07)歲。對照組(n=75)，男性43例(57.3%)，女性32例(42.7%)，平均年齡(66.96±8.68)歲。XFS組和對照組之間在年齡(t=0.173,P=0.868)和性別方面均無明顯差異(χ2=0.383,P=0.536)。

2.2XFS組與對照組LOXL1基因甲基化狀態比較維吾爾族剝脫綜合征患者64例，其中發生甲基化17例，未發生甲基化47例，即維吾爾族剝脫綜合征患者LOXL1基因甲基化率為26.6%(17/64)，維吾爾族剝脫綜合征健康對照組共75例，其中發生甲基化的為9例，未發生甲基化的為66例，即維吾爾族正常對照組LOXL1基因甲基化率12%(9/75)。新疆維吾爾族人群LOXL1基因甲基化狀態在兩組間存在差異，見表1，且差異有統計學意義。電泳結果顯示病例組的甲基化程度明顯高于對照組，見圖1。

表1　血LOXL1 基因甲基化狀態

注：病例組XFS (樣本10,18,25,26,32和 40)；對照組 Control(樣本7,13,28,29,40 和 43)； U：非甲基化； M：甲基化。

2.3XFS患者LOXL1基因甲基化狀態與臨床特征的關系數據見表2。

2.3.1XFS患者LOXL1基因甲基化狀態與性別的關系維吾爾族剝脫綜合征人群中男性患者9例發生了甲基化，31例沒有發生甲基化，男性剝脫綜合征患者LOXL1基因的甲基化率為22.5%(9/40)；而女性剝脫綜合征患者8例發生了甲基化，16例沒有發生甲基化，女性剝脫綜合征患者LOXL1基因的甲

表2　剝脫綜合征患者LOXL1 基因甲基化與臨床

注：a：理論值小于5的頻數為0。

基化率為33.3%(8/24)。對性別不同的剝脫綜合征患者LOXL1基因的甲基化率行χ2檢驗顯示性別在兩組間沒有明顯差異，且差異無統計學意義(χ2=0.902，P=0.343)。

2.3.2XFS患者LOXL1基因甲基化狀態與年齡的關系我們將維吾爾族剝脫綜合征人群按年齡分為兩組，即60～70歲組和≥70歲組，60～70歲組的剝脫綜合征患者5例發生甲基化，7例未發生甲基化，60～70歲組的剝脫綜合征患者LOXL1基因的甲基化率為41.7%(5/12)；而≥70歲組的剝脫綜合征患者12例發生了甲基化，40例未發生甲基化，≥70歲組的剝脫綜合征患者LOXL1基因的甲基化率為30%(12/40)。對年齡不同的剝脫綜合征患者LOXL1基因的甲基化率行χ2檢驗，顯示年齡在兩組間沒有明顯差異，且差異無統計學意義(χ2=1.727，P=0.189)。

本次研究發現，對性別和年齡不同的剝脫綜合征患者LOXL1基因的甲基化率比較顯示性別在兩組間均無明顯差異，且無統計學意義(P>0.05)。

3討論

DNA 的甲基化修飾屬于表觀遺傳學的研究范疇，本次研究發現CpG島位于第一外顯子區域，我們知道啟動子位于基因序列的上游，轉錄的起始區域內，起到調控下游的外顯子的作用。異常的DNA甲基化模式對于理解與人類衰老有關的表型的變化具有重要作用。Gravina 等[13]對年幼和年長小鼠的肝臟和大腦皮層基因的啟動子區域100個CpG位點分析表明在衰老進程中該兩個器官均存在異常高甲基化標記，并且隨著年齡增長涉及DNA異常甲基化，原因可能是特定的細胞反應與年齡相關。Raddatz 等[14]通過對人類單堿基中與年齡相關的甲基化改變的研究發現，在啟動子和增強子區域與改變轉錄活性相關聯的甲基化處于高度異常，并且衰老與表觀基因中的基因調控元件有關。以上這些研究均表明了甲基化與衰老之間存在一定的關聯性，即隨著年齡的增加甲基化含量逐漸減少。而剝脫綜合征是全身結締組織的異常細胞外基質異常增生性疾病，與老年細胞代謝過程異常有關。大量研究[15-16]均揭示疾病相關基因呈現異常甲基化并參與疾病發病機制，最終導致了組織細胞的異常聚集，提示XFS患者LOXL1基因的甲基化狀態亦值得我們研究。

將維吾爾族剝脫綜合征人群按性別和年齡分類研究后發現：男性剝脫綜合征患者LOXL1基因的甲基化率為22.5%，女性剝脫綜合征患者LOXL1基因的甲基化率為33.3%；60～70歲組的剝脫綜合征患者LOXL1基因的甲基化率為41.7%；而≥70歲組的剝脫綜合征患者LOXL1基因區的甲基化率為30%。顯示剝脫綜合征患者的性別和年齡在兩組間差異無統計學意義。而剝脫綜合征患者與健康人群的甲基化狀態研究顯示新疆維吾爾族剝脫綜合征患者LOXL1基因甲基化率為26.6%，而維吾爾族正常對照組LOXL1基因區甲基化率僅為12%，說明了LOXL1基因甲基化狀態在新疆維吾爾族人群的剝脫綜合征和維吾爾族健康人群兩組間存在差異。揭示與剝脫綜合征相關的LOXL1基因呈現的異常甲基化可能與剝脫綜合征的發病有關，導致組織細胞異常聚集，故本研究只是發現了剝脫綜合征患者與健康對照組間甲基化程度不同，但具體的程度變化仍然不清，且剝脫綜合征患者與正常人群間的甲基化程度是否存在種族差異，也尚不清楚，因為本次的研究對象均為新疆維吾爾族人群(漢族人群的剝脫綜合征患者極少)，這使得該研究存在一定的局限性。當然本實驗的研究對象的樣本量還比較小，還需要更大樣本量和更多的重復實驗來探討LOXL1基因作為維吾爾族剝脫綜合征患者特異性的表觀遺傳學標記物的可能。

XFS是一種與年齡有關的復雜疾病，它的起病是包括遺傳因素和環境因素等多因素綜合作用的結果，隨著對甲基化的深入研究，基因啟動子區及第一外顯子區異常甲基化作為疾病分子標志物,同時與其它標志物如基因突變等聯合分析將有利于提高疾病診斷的特異性，必將在疾病的早期診斷、監測高危人群、判斷疾病預后及其它領域得到更加廣泛的應用。

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Change of DNA methylation in exfoliation syndrome

in Uyghur population

TANG Yan1,FU Jing1，REXITI·Shamaiti2，et al

(1.DepartmentofOphthalmology,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,

Urumchi,Xinjiang830054,China；2.DepartmentofOphthalmology,XinjiangPeople's

HospitalofBozhou,Xinjiang833400,China)

Abstract:ObjectiveBy detecting LOXL1 gene methylation status in peripheral blood between exfoliation syndrome (XFS) patients and healthy population in Xinjiang Uygur population to clarify the changes of exfoliation syndrome LOXL1 gene methylation status and its role in the pathogenesis of XFS,which may be applied as a molecular marker for early clinical detection of Uyghur exfoliation syndrome.Methods64 Uyghur patients with exfoliation syndrome were collected from March 2012 to May 2013 in the first affiliated hospital of xinjiang medical university and the first people hospital of Kashi,and 75 cases of normal volunteers were also included.Methylation-specific polymerase chain reaction (MSP) method was used to detect methylation of specimens. ResultsUygur population with exfoliation syndrome LOXL1 gene methylation was 26.6% (17/64),whereas in the normal control group,LOXL1 gene methylation was 12% (9/75).ConclusionsLOXL1 gene is an integrated genetic susceptibility genes in Uygur population with exfoliation syndrome.The methylation levels of LOXL1 gene promoter were significantly higher in XFS patients and it may be associated with the onset of exfoliation syndrome.

Key words:exfoliation syndrome;DNA methylation;Uyghur population

(收稿日期：2014-11-10，修回日期：2015-01-05)

通信作者：陳雪藝，女，教授，博士生導師，研究方向：玻璃體視網膜疾病診療，E-mail：ykcangel@163.com

基金項目：國家自然科學基金(No 81360377H1208)；新疆維吾爾族自治區自然基金(No 2013211A103)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.08.015