黑逍遙散對Aβ25～35誘導AD模型大鼠腦組織神經遞質及海馬病理改變的影響

吳紅彥李海龍顧　靜蘭美華王虎平車　敏鄧健男(甘肅中醫(yī)學院甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉化重點實驗室，甘肅　蘭州　70000)

黑逍遙散對Aβ25～35誘導AD模型大鼠腦組織神經遞質及海馬病理改變的影響

吳紅彥1李海龍1顧靜1蘭美華2王虎平1車敏1鄧健男3
(甘肅中醫(yī)學院甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉化重點實驗室，甘肅蘭州730000)

〔摘要〕目的觀察黑逍遙散對Aβ25～35誘導阿爾茨海默病(AD)模型大鼠學習記憶能力改善作用、腦組織乙酰膽堿酯酶(AchE)、膽堿乙酰轉移酶和(ChAT)、單胺氧化酶(MAO)及海馬病理改變的影響，探討黑逍遙散防治AD的作用及其機制。方法110只SD大鼠先隨機挑選16只為假手術組，余下作為造模組，經過7 d的水迷宮實驗，剔除記憶力異常的大鼠。造模組再按隨機數字表分為模型組、陽性對照組及黑逍遙散高、中、低劑量組。采用Aβ25～35海馬區(qū)注射誘發(fā)大鼠AD模型;高、中、低劑量組分別按4.25、8.50和17.0 g·kg－1·d－1灌胃給藥，陽性對照組給予哈伯因(0.02 mg·kg－1·d－1)灌胃，每組14只，給藥時間持續(xù)28 d。Morris水迷宮檢測各組大鼠學習記憶能力的變化，最后一次水迷宮后，處死大鼠，收集大鼠海馬及血液樣本。ELISA法測大鼠腦勻漿AchE、ChAT、MAO活性; HE染色法觀察海馬病理損傷;電鏡觀察各組大鼠海馬組織超微結構的變化。結果黑逍遙散能改善Aβ25～35所致AD模型大鼠行為學功能，提高學習和記憶能力;降低AD大鼠腦組織AchE和MAO活性、升高ChAT活性(P＜0.05) ;改善Aβ25～35所致AD模型大鼠AD大鼠海馬病理損傷。結論黑逍遙散改善AD大鼠學習記憶力、保護AD模型大鼠腦組織結構和功能，這可能與其調節(jié)膽堿能和單胺類神經元神經遞質有關。

〔關鍵詞〕黑逍遙散;阿爾茨海默病; Aβ25～35;神經遞質

1甘肅省中藥新產品創(chuàng)制工程實驗室

2陽江市中醫(yī)院3武漢市中醫(yī)院

第一作者:吳紅彥(1963-)，男，教授，博士生導師，主要從事方劑藥理與新藥開發(fā)研究。

Effects of Heixiaoyao powder on the expressions of AchE，ChAT and MAO of hippocampus tissue and serum in Alzheimer＇s disease rat model induced by Aβ25～35fragments

WU Hong-Yan，LI Hai-Long，GU Jing，et al.
Gansu University of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730000，Gansu，China

【Abstract】Objective To explore the influence of Heixiaoyao powder on learning and memory ability，cerebral neurotransmitters and the pathological changes of hippocampus tissue in Alzheimer＇s disease(AD) rats induced by Aβ25～35．Methods The SD rats were randomly divided into sham surgery rats and model groups，and all rats of model group were given water maze tests for 7 days．These eligible rats were randomly divided into model，positive control，Heixiaoyao powder high，medium and low dose groups，14 rats in each group．Aβ25～35fragments was injected into the hippocampus to make the rat’s AD mode1．All rats of Heixiaoyao powder group were orally administered Heixiaoyao powder at low，medium and high doses(4．25，8．50，17．0 g·kg－1·d－1)，the positive control group was orally given huperzine A solution 0.02 mg ·kg－1·d－1，model and sham groups were given equal volume double distilled water daily for 28 d．The learning and memory ability of rats were detected by Morris water maze; brain homogenate stration of AchE，ChAT，MAO were examined by chemistry chromatometry．After the last administration，the rats were sacrificed and the serum and hippocampus homogenate stration of AchE，MAO，ChAT were examined by ELISA．Results Heixiaoyao powder improved the behavioral function of AD rats induced by Aβ25～35．Compared with those of model group，Heixiaoyao powder obviously decreased the activities of AchE and MAO and increased the active of ChAT in brain tissue(P＜0．05)．Conclusions Heixiaoyao powder could improve the learning and memory ability of AD rats，and the effect might be related to regulating the levels of cholinergic transmitter and cerebral monoamine neurotransmitters．

【Key words】Heixiaoyao powder; Alzheimer＇s disease; Aβ25～35fragments; Neurotransmitters

阿爾茨海默病(AD)是一種常見的以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的神經系退行性病變。神經遞質在AD中的改變及其在AD中的地位是研究AD的一個重要方面。我們曾報道逍遙散具有顯著改善AD模型小鼠學習記憶能力、增強小鼠認知、判斷能力以及調節(jié)腦內相關神經遞質的作用〔1，2〕，本實驗采用黑逍遙散干預Aβ25～35誘導的AD大鼠模型〔3〕，以Morris水迷宮檢測各組大鼠學習記憶能力的變化;酶聯免疫分析(ELISA)法測大鼠腦勻漿乙酰膽堿酯酶(AchE)、膽堿乙酰轉移酶(ChAT)和單胺氧化酶(MAO)活性; HE染色法觀察海馬病理損傷;電鏡觀察各組大鼠海馬組織超微結構的變化，探討黑逍遙散防治AD的作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物SPF級SD大鼠110只，體重(200±20) g，鼠齡4～5個月，由甘肅中醫(yī)學院科研實驗動物中心提供，符合SPF級實驗動物標準，實驗動物使用許可證號: SYXK(甘) 2011-0001，使用實驗動物質量合格證編號: scxk(甘) 2011-0001-0001058。

1.2藥物黑逍遙散各組成生藥由甘肅中醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥房提供，各藥用量按2010版《中國藥典》比例，熟地∶柴胡∶當歸∶白芍∶茯苓∶白術∶生姜∶甘草∶薄荷=7.5∶5∶5∶5∶5∶5∶5∶4∶1。采用傳統水煎法，加中藥10倍量的冷水浸泡3 h，然后加熱煮沸1 h，加入薄荷再煎5 min，濾出煎液，藥渣中再加6倍量水煮沸1 h，濾出煎液，合并兩次煎液，80目篩濾過，濾液水浴蒸發(fā)濃縮，分別制成濃度為含生藥量2.0、1.0、0.5 g/ml的黑逍遙散水煎液。石杉堿甲片(哈伯因)由河南太龍藥業(yè)股份有限公司生產(國藥準字HIO940156，生產批號110402)，用雙蒸水配制成0.002 mg/ml水溶液，4℃冰箱中備用。Aβ25～35由上海強耀生物科技有限公司提供(批號: 20110609)。Aβ25～3510 μg溶于無菌生理鹽水1 μl，使用前37℃下孵育1 w，使其呈凝聚態(tài)備用。

1.3主要試劑大鼠AchE檢測試劑盒(批號: 20111206)、ChAT ELISA檢測試劑盒(批號: 20111206)及MAO ELISA檢測試劑盒(批號: 20111206)均購于上海晶天科技有限公司。

1.4模型復制各模型大鼠經腹腔注射3％戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉，參考包新民《大鼠腦立體定向圖譜》定位方法，大鼠固定于立體定位儀上，確定海馬區(qū)注射點:前囟后3 mm，中線向左右各旁開2.2 mm，硬腦膜下2.8 mm。用牙科鉆在顱骨上鉆孔(直徑約1 mm)，用微量進樣器在兩側各緩慢注射Aβ25～35溶液1 μl，5 min內注射完，留針5 min，牙科泥封住顱骨孔，術區(qū)滴慶大霉素，縫合皮膚并消毒，假手術組注入等量生理鹽水，其余同模型組。單籠飼養(yǎng)至大鼠完全清醒。

1.5動物分組大鼠稱重，先按隨機數字表挑選16只大鼠作為假手術組，其余大鼠手術7天后進行水迷宮測試，根據測試結果，以假手術組平均逃避潛伏期為標準，從手術造模大鼠中篩選出大于此值的學習記憶障礙大鼠，剔除不合格大鼠17只。大鼠稱重，再按照隨機數字表法將大鼠分為5組，分別為模型組、陽性對照組、黑逍遙散高、中及低劑量組，每組14只。假手術組大鼠也為14只。因為麻醉、手術操作不當等原因，大鼠死亡9只。

1.6動物給藥低、中、高劑量黑逍遙散各組大鼠分別按4.25、8.50、17.0 g·kg-1·d-1灌胃給藥;陽性對照組給予哈伯因溶液0.02 mg·kg-1·d-1灌胃;模型組、假手術組給予等容量雙蒸水，每日上午1次，連續(xù)灌胃治療28 d。中劑量組動物給藥劑量按照人的臨床給藥劑量的相應倍數折算。

1.7Morris水迷宮測試

1.7.1定位航行實驗用于測量大鼠對水迷宮的學習記憶能力。第1天讓大鼠自由游泳，上、下午各訓練1次。第2天開始正式對各只大鼠進行Morris水迷宮測試。安全平臺放置于水迷宮中一固定象限，離池壁20 cm。在測試前給大鼠頭部涂抹黃色的苦味酸作標記，向水迷宮水池中加入適量白色素二氧化鈦粉，攪拌，再加自來水至水面高出安全平臺1 cm，使池水為不能明顯見到安全平臺的不透明乳白色。水溫保持在24℃～25℃。實驗室保持安靜，窗戶遮以不透光窗簾，室內以恒定日光燈照明，亮度均等，水池周圍參照物在進行水迷宮實驗的幾天時間內位置保持不變，大鼠游泳時實驗者穿著工作服。將大鼠面向池壁放入水中，每天測試1次，每只每次測試120 s，連續(xù)5 d，記錄大鼠尋找并爬上平臺所需時間(逃避潛伏期)。如果大鼠在120 s內未找到平臺，須將其引至平臺，讓其在平臺上停留15 s，這時逃避潛伏期記為120 s。每次測試時若大鼠在120 s之內找到平臺，也讓其在平臺上停留15 s，這樣結束一次測試。

1.7.2空間搜索實驗用于測量大鼠學會尋找平臺后對平臺空間位置記憶的能力。在測試第6天，撤除水下平臺，讓大鼠在無平臺情況下尋找記憶中的平臺。隨機選取一入水點，將大鼠面向池壁放入水中，每只大鼠限時游120 s，記錄其在120 s內游過原平臺相應位置的次數。

1.7.3標本制備和指標檢測治療28 d后采集標本。取血后斷頭處死大鼠，并立即在冰臺上開顱，快速取出大腦，除去腦干和小腦。取右側腦組織，稱重。將腦組織用冰冷的生理鹽水漂洗后，用濾紙拭干，用精密天平準確稱重。用腦組織重量9倍的0.9％生理鹽水和腦組織一起放入電動勻漿機研碎(在冰水中進行)，配成10％的組織勻漿液4℃，3 000 r/min離心10 min，取上清液，置4℃冰箱保存，按照試劑盒說明書進行AchE、ChAT、MAO的測定。

1.7.4病理切片制備大鼠斷頭處死，低溫條件下快速剖取腦組織，除去腦干和小腦，定位于海馬，一半腦組織放置于4％多聚甲醛溶液中固定，以備做HE染色。部分海馬取材1 mm3大小，3％戊二醛固定2 h，以備做透射電鏡檢測。

1.8統計學處理應用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。

2　結果

2.1Morris水迷宮檢測各組大鼠學習記憶能力的變化治療前，各組與假手術組結果比較差異均顯著(P＜0.05)。治療后第28天，模型組治療前后潛伏期比較差異無顯著性意義(P＞0.05)。而黑逍遙散各劑量組、陽性對照組與模型組相比差異有統計學意義(P＜0.05)。與陽性對照組相比，治療后，黑逍遙散低劑量組學習潛伏時間延長(P＜0.05) ;中劑量組學習潛伏時間與之相當，無顯著性差異(P＞0.05) ;高劑量組潛伏時間顯著減少(P＜0.05)。自身比較，治療后與治療前相比，黑逍遙散各劑量組、陽性對照組的潛伏期均減少，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1　不同時期大鼠Morris水迷宮實驗潛伏期(±s，n=14)

表1　不同時期大鼠Morris水迷宮實驗潛伏期(±s，n=14)

與假手術組比較: 1) P＜0.05;與模型組比較: 2) P＜0.05，;與陽性對照組比較: 3) P＜0.05;與同組治療前相比: 4) P＜0.05;下表同

組別　　治療前(s)　　治療后28 d(s)假手術組　29.94±9.67　30.60±8.85模型組　102.95±6.351)　108.39±3.30陽性對照組　105.26±5.361)　65.73±6.112) 4)黑逍遙散低劑量組　102.25±6.421)　70.26±5.392) 3) 4)黑逍遙散中劑量組　101.42±4.811)　68.78±6.272) 4)黑逍遙散高劑量組　103.75±6.471)　58.21±5.912) 3) 4)

2.2不同時期各組大鼠穿越平臺次數比較治療前，各組大鼠與假手術組比較，穿越平臺的次數顯著減少(P＜0.05)。治療后，與陽性對照組比較，黑逍遙散低劑量組穿越平臺的次數顯著減少(P＜0.05) ;中劑量組穿越平臺的次數與之相當(P＞0.05) ;高劑量組穿越平臺的次數顯著增加(P＜0.05) ;自身比較，治療后與治療前比較，假手術組和模型組大鼠穿越平臺的次數相差不大，差異無顯著性意義(P＞0.05)，陽性對照組、黑逍遙散各劑量組大鼠穿越平臺的次數均有所增加，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2　不同時期各組大鼠穿越平臺的次數(±s，n=14)

表2　不同時期各組大鼠穿越平臺的次數(±s，n=14)

組別　　治療前(次)　　治療后28 d(次)假手術組　2.78±1.20　2.49±0.88模型組　0.71±0.761)　0.57±0.53陽性對照組　0.73±0.751)　2.18±0.752) 4)黑逍遙散低劑量組　0.76±0.351)　2.28±0.652) 3) 4)黑逍遙散中劑量組　0.75±0.511)　2.46±1.312) 4)黑逍遙散高劑量組　0.77±0.341)　2.69±0.732) 3) 4)

2.3黑逍遙散對AD大鼠腦組織勻漿AchE、ChAT和MAO活性的影響與假手術組比較，模型組大鼠腦勻漿中的AchE含量顯著增高，ChAT活性顯著降低(P＜0.05) ;與模型組比較，各治療組大鼠腦勻漿中的AchE活性顯著減弱，ChAT活性顯著增強(P＜0.05) ;與陽性對照組比較，黑逍遙散低劑量組AchE活性增強，ChAT活性減弱(P＜0.05) ;中劑量組AchE、ChAT活性與之相當，無顯著性差異(P＞0.05) ;黑逍遙散高劑量組AchE活性減弱，ChAT活性增強(P＜0.05) ;黑逍遙散各劑量組AchE活性逐漸減弱，劑量依賴性降低，相關系數r=－0.99，ChAT活性逐漸增強，劑量依賴性升高，相關系數r=0.95，見表3。

表3　黑逍遙散對AD大鼠腦組織勻漿AchE、ChAT和MAO活性的影響(±s，n=14)

表3　黑逍遙散對AD大鼠腦組織勻漿AchE、ChAT和MAO活性的影響(±s，n=14)

組別　AchE (U/L) ChAT (ng/ml) MAO (ng/ml)假手術組　31.43±3.21　 17.36±1.10　 8.78±0.13模型組　55.12±3.161)　9.23±1.781)　3.27±0.171)陽性對照組　42.60±3.102)　14.38±1.672)　9.39±0.142)黑逍遙散低劑量組　48.93±3.022) 3)　12.86±1.592) 3)　11.25±0.142) 3)黑逍遙散中劑量組　42.72±3.092)　13.81±1.112)　9.48±0.152)黑逍遙散高劑量組　5.41±3.132) 3)　15.94±1.202) 3)　8.94±1.612)

2.4黑逍遙散對AD大鼠腦組織AD大鼠海馬病理損傷和超微結構的影響假手術組大鼠腦組織神經元細胞結構清晰，排列密集，極少量膠質細胞;模型組神經元細胞結構模糊，錐體細胞排列紊亂，膠質細胞增生，有些部位神經元細胞減少;陽性對照組大多數神經元細胞結構清晰，排列較整齊，細胞數目減少，膠質細胞增生;黑逍遙散低劑量組神經元細胞結構較清晰，排列欠整齊，細胞數目減少，膠質細胞增生;黑逍遙散中劑量組神經元細胞結構較清晰，排列欠整齊，細胞數目減少，膠質細胞輕度增生;黑逍遙散高劑量組大多數神經元細胞結構清晰，排列較整齊，細胞數目輕度減少，膠質細胞少量增生。見圖1。

圖1　海馬HE染色圖片(×10)

圖2　神經元透射電鏡圖片

如圖2所示，電鏡下假手術組海馬神經元分布正常，見核膜平整光滑，核呈圓形或橢圓形，核周胞質細胞器結構清晰，見高爾基體，線粒體，粗面內質網，核糖體結構;模型組神經元細胞核異染色質增多，染色質邊集，核周胞質電子密度降低，細胞器腫脹，神經元細胞胞質內較多脂褐素顆粒;陽性對照組大部分神經元細胞結構趨于正常，有髓神經纖維髓鞘結構基本正常，大部分腦血管結構正常，血管外周間隙腫脹也明顯緩解，僅見少量神經元細胞核形態(tài)異常，胞質內細胞器腫脹，少量脂褐素顆粒;黑逍遙散低劑量組核形態(tài)異常的神經元細胞，胞質內見較多脂褐素顆粒;黑逍遙散中劑量組部分神經元細胞細胞核異形，核周胞質細胞器腫脹，胞質內電子密度降低，局部神經元細胞神經氈部腫脹，腦血管外周間隙擴張，電子密度降低;黑逍遙散高劑量組大部分神經元細胞結構正常，有正常髓神經纖維髓鞘結構，少量神經元細胞核形態(tài)異常。

3　討論

膽堿能假說是AD發(fā)病的重要機制之一。有研究表明〔4，5〕，AD發(fā)病與多種中樞神經遞質如AchE、5-HT及DA等興奮性氨基酸等的異常有關，其中膽堿能神經系統功能缺陷尤為突出。AchE是體內重要的神經遞質，在機體學習與記憶方面發(fā)揮著重要的作用。基底前腦膽堿能神經元-海馬-皮層和它們之間的通路，是學習記憶功能的重要結構基礎。AD患者基底前腦膽堿能神經元大量受損或死亡，突觸前AchE的合成ChAT的活性以及對膽堿的攝取能力都明顯下降，這些變化的程度與患者認知功能損害的程度呈正相關〔6〕。本實驗結果表明，黑逍遙散能改善Aβ25～35所致AD模型大鼠行為學功能，提高學習和記憶能力;并可降低AD大鼠腦組織AchE和MAO活性、升高ChAT活性;還可改善Aβ25～35所致AD模型大鼠AD大鼠海馬病理損傷。由此可見，黑逍遙散可通過調節(jié)中樞膽堿能神經遞質和單胺類神經遞質作用起到改善學習記憶、保護AD模型大鼠的作用。

現代藥理學研究表明，黑逍遙散組方中熟地黃、茯苓、當歸中所含的有效成分藁本內酯、阿魏酸、白芍總甙、茯苓多糖均具有一定的抗衰老作用〔7～13〕。王曉琳等〔13〕總結中藥復方治療老年癡呆的用藥規(guī)律，發(fā)現抗老年癡呆使用頻率高的14味藥材就包括熟地黃、白術、茯苓、當歸和甘草，表明本方中所含中藥具有抗衰老的藥效物質基礎。

中醫(yī)一般認為本病病位在腦，發(fā)病以內因為主，與肝、腎、心等臟功能失調密切相關，證屬本虛標實，氣、血、瘀、痰郁結為患。所以治療多以補腎填精為主，輔以理氣化痰，活血化瘀之品。臨床研究和動物實驗都表明補腎活血法和補腎健脾等治療方法都能夠有效改善AD癥狀〔14～16〕。筆者通過文獻回顧分析，結合現代醫(yī)學研究，認為AD的發(fā)生也與肝密切相關，治療AD也應該重視從肝論治。黑逍遙散為其典型代表方逍遙散基礎上再加一味熟地，更兼顧了肝腎同補，結合前期進行的相關藥效學、作用機制的研究，結果表明黑逍遙具有顯著改善AD模型大鼠學習記憶能力，增強大鼠認知、判斷能力，這與其調節(jié)大鼠腦內相關神經遞質的作用有著密切關系。

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〔2015-01-22修回〕

(編輯李相軍)

基金項目:國家自然科學基金項目(No．81060284)

〔中圖分類號〕R749

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4417-04;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.001