壯醫藥線點灸聯合針挑療法對大鼠抗氧化損傷與衰老的影響

唐漢慶　鄭建宇　竇錫彬　李克明　趙玉峰　李曉華　舒方義　廉春容　楊園園(右江民族醫學院，廣西　百色　533000)

壯醫藥線點灸聯合針挑療法對大鼠抗氧化損傷與衰老的影響

唐漢慶鄭建宇竇錫彬李克明趙玉峰李曉華舒方義廉春容楊園園
(右江民族醫學院，廣西百色533000)

〔摘要〕目的探討壯醫藥線點灸聯合針挑療法抗氧化損傷與衰老的效果。方法SPF級Wistar大鼠100只隨機分為正常對照組(簡稱對照組)、模型組、藥線組、針挑組及藥線+針挑組(簡稱聯合組)，每組20只。藥線組、針挑組、聯合組分別給予藥線點灸、針挑和藥線點灸、針挑聯合應用治療。對照組、模型組不予特殊處理。連續3個療程。檢測活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)、腦脂褐素(LF)活性或水平變化及形態學觀察端粒酶表達。結果與對照組比較，模型組ROS、MDA和LF水平升高或顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)，SOD、GSH-Px活性均顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較，聯合組SOD、GSH-Px活性升高最顯著(P＜0.01) ; ROS水平、MDA水平和LF水平均下降或顯著下降(P＜0.05或P＜0.01)。與對照組比較，模型組端粒酶表達密度減少，表達活性降低。與模型組比較，藥線組和針挑組端粒酶表達密度增強，表達活性上升;而聯合組端粒酶表達密度顯著增強，表達活性顯著上升。結論壯醫藥線點灸聯合針挑療法可增強抗氧化酶活性和端粒酶表達，提高抗氧化能力，可能是其抗衰老的機制之一。

〔關鍵詞〕壯醫藥線點灸;壯醫針挑;抗氧化;抗衰老

第一作者:唐漢慶(1976-)，男，副教授，博士，主要從事民族醫藥與中西醫結合基礎研究。

The effects of anti-oxidative damage and anti-aging by treatment of Zhuang medical thread moxibustion combined with Zhuang acupuncture

TANG Han-Qing，ZHENG Jian-Yu，DOU Xi-Bin，et al.
Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China

【Abstract】Objective To investigate the effects of anti-oxidative damage and anti-aging by treatment of Zhuang medical thread moxibustion combined with Zhuang acupuncture．Methods One hundred Wistar mice，SPF grade，were divided randomly into control，model，medical thread，acupuncture，combined groups with twenty mice in each group．Medical thread，acupuncture，combined groups were respectively treated with Zhuang medical thread moxibustion，Zhuang acupuncture and Zhuang medical thread moxibustion combined with Zhuang acupuncture．The levels of ROS，MDA，LF(lipofusin)，activity of SOD，GSH-Px were tested and morphologic changes of telomerase were observed．Results Compared to those of control group，the levels of ROS，MDA，LF were increased in model group (P＜0．05 or P＜0．01)，the activities of SOD，GSH-Px were decreased significantly (P＜0．01)．Compared to those of model group，the activities of SOD and GSH-Px were increased significantly in combined group (P＜0．01) while the levels of ROS，MDA，LF were reduced(P＜0．05 or P＜0．01)．Compared to those of control group，the expression density and activity of telomerase were reduced in model group．Compared to those of model group，the expression density and activity of telomerase were increased in medical thread and acupuncture groups and they were increased obviously in combined group．Conclusions Zhuang medical thread moxibustion combined with Zhuang acupuncture could enhance activity of antioxidant enzyme and expression of telomerase and improve ability of antioxidation，which might be one of anti-aging mechanisms．

【Key words】Zhuang medical thread moxibustion; Zhuang acupuncture; Antioxidation; Anti-aging

壯醫藥線點灸和針挑療法均是壯醫的特色醫技療法。藥線點灸療法已經被實踐證明對慢性疼痛、老年病、失眠、哮喘、風濕病等許多慢性病、疑難雜癥有良好的療效，具有科學性、創新性、實用性〔1〕。壯醫針挑療法也是壯醫的特色醫技療法，對哮喘、失眠、腰痛、甲亢、皮膚病、風濕痛等適宜病癥療效較好，也有不少的報道〔2〕。對這兩種技法的臨床治療報道較多，近來對兩種技法在延緩衰老、養生保健方面的研究也引起重視，研究表明抗衰老和抗氧化作用是相互聯系的，與體內自由基增多及端粒酶表達的變化有關〔3，4〕。本研究觀察壯醫藥線點灸和針挑療法對衰老大鼠的抗氧化和抗衰老作用并討論其可能機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物與分組SPF級Wistar大鼠100只，雌雄各半，體質量(173.18±7.65) g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號: SCXK(京) 2013-0004。動物在安靜環境下分籠飼養，室溫控制在(23±1)℃范圍內，相對濕度65％～70％，大鼠以基礎飼料常規飼養，自由飲水，大鼠適應性飼養3 d后，隨機數字表法分為5組:正常對照組(簡稱對照組)、模型組、藥線組、針挑組及藥線+針挑組(簡稱聯合組)。每組20只。所有實驗大鼠的使用和喂養遵照《關于善待實驗動物的指導性意見》(2006)相關條款。

1.2主要試劑和儀器D-半乳糖(北京化學試劑公司，批號: 20110625)、超氧化物歧化酶(SOD，批號2013X0115)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px，批號20130206)、丙二醛(MDA，批號201302032)、活性氧(ROS，批號201306002)、腦脂褐素(LF，批號20131003)檢測試劑盒(武漢博士德公司提供) ;兔抗端粒酶多克隆抗體(Sigma，USA)、羊抗兔IgG及DAB顯色試劑盒(武漢博士德公司)。

臺式高速低溫離心機(Z360K型，德國HERMLE公司)、電子天平(AE160型，瑞士Mettler公司)、分光光度計(722型，上海精密科學儀器有限公司)、熒光分光光度計(F-3000型，日本日立)、電動玻璃勻漿機(DY-89型，寧波新芝公司)、酶標儀(MK3型，Thermo Labsystem公司)、電腦快速恒冷冷凍石蠟兩用切片機(KD-2258-VI，浙江科迪)、熒光顯微鏡(Olympus IX51，日本)和倒置式生物顯微鏡(DMIL LED，德國萊卡)。

1.3造模方法及分組處理采用D-半乳糖腹腔注射造模，造模后分為模型組、藥線組、針挑組采用聯合組，余下為對照組。

藥線組:取雙側足三里穴位(ST36)，拇指和食指手持中號壯醫藥線(藥線直徑為0.7 mm)在酒精燈或蠟燭上點燃后，熄滅藥線明火火焰，此時藥線剩下圓珠狀炭火星，順應手腕和拇指的屈曲動作，拇指指腹穩重而敏捷地將有圓珠狀炭火星線頭直接點壓于足三里穴位上，火滅即起稱為1壯，每穴每次共灸3壯。每天每穴點灸1次。7 d為1個療程，間隔1 d繼續下個療程。

針挑組:取雙側陽陵泉(GB34)、環跳(GB30)穴位。穴位皮膚常規消毒，采用消毒大號縫衣針將上述穴位作為針挑點，用拇指、食指、中指合攏把針握緊，挑出皮下一些白色纖維組織，然后用針在該穴位垂直快速點刺3次，刺入皮下1 mm，點刺后以5％碘酒、75％酒精消毒，每天每穴位挑刺1次。7 d為1個療程，間隔1天繼續下個療程。

聯合組:聯合采用上述藥線組和針刺組的操作方法。藥線組、針挑組、聯合組均進行連續3個療程的處理。模型組和對照組不作特殊處理。

1.4指標檢測療程結束后處死大鼠。取靜脈血2 ml，離心(4℃，1 000 r/min，10 min)，分離血清，－70℃凍存。采用比色法測定血清ROS活性，二硫代二硝基苯甲酸法測定GSH -Px活性，黃嘌呤氧化酶法測定血清SOD活性;硫代巴比妥酸法測定MDA含量。另取大鼠腦組織液氮中凍存，檢測前用生理鹽水制備成10％勻漿，離心(4℃，3 000 r/min，15 min)，取上清熒光法測定LF含量。均嚴格按說明書操作進行檢測。

1.5端粒酶表達形態觀察免疫組化法檢測，大鼠腦組織置于電腦快速恒冷冷凍石蠟兩用切片機，進行連續切片，片厚10 μm，PBS泡洗30 min，干燥后進行端粒酶免疫組化染片，加入兔抗端粒酶多克隆抗體室溫避光孵育10 h，洗去一抗，加FITC標記羊抗兔IgG孵育3 h，洗去二抗，DAB顯色試劑盒顯色，干燥，封片，顯微鏡下觀察并拍攝。

1.6統計學處理采用SPSS13.0軟件。計量資料采用單因素方差分析，樣本均數間的兩兩比較用LSD檢驗方法。

2　結果

2.1SOD活性檢測結果與對照組〔(193.28±16.78) U/ml〕比較，模型組SOD活性〔(90.14±6.88) U/ml〕顯著下降(P＜0.01)。與模型組比較，藥線組〔(141.21±10.02) U/ml〕和針挑組〔(156.78±12.84) U/ml〕SOD活性上升(P＜0.05) ;而聯合組SOD活性〔(189.98±18.26) U/ml〕顯著上升，接近對照組水平，與模型組比較差異顯著(P＜0.01)。

2.2GSH-Px活性檢測結果與對照組〔(104.28± 8.83) U/ml〕比較，模型組〔(30.29±3.84) U/ml〕GSH-Px活性顯著下降(P＜0.01)。與模型組比較，藥線組〔(52.31± 4.12) U/ml〕GSH-Px活性有升高，但無統計學差異(P＞0.05) ;與模型組比較，針挑組GSH-Px活性〔(82.33±5.02) U/ml〕上升(P＜0.05) ;而聯合組GSH-Px活性〔(95.29±8.39) U/ml〕顯著上升，趨近對照組水平，與模型組比較差異顯著(P＜0.01)。

2.3端粒酶表達形態觀察與對照組比較，模型組端粒酶表達密度減少，表達活性降低。與模型組比較，藥線組和針挑組端粒酶表達密度增強，表達活性上升;而聯合組端粒酶表達密度顯著增強，表達活性顯著上升，見圖1。

圖1　各組端粒酶表達形態比較(IHC，×40)

2.4ROS、MDA和LF檢測結果與對照組比較，模型組ROS、MDA和LF水平升高或顯著升高(P＜0.05或P＜0.01) ;與模型組比較，藥線組ROS、MDA和LF水平有下降趨勢，但無統計學差異(P＞0.05) ;針挑組ROS、MDA和LF水平下降(P＜0.05) ;聯合組ROS、MDA和LF水平下降或顯著下降(P＜0.05或P＜0.01)，見表1。

表1　各組ROS、MDA和LF水平比較(±s)

表1　各組ROS、MDA和LF水平比較(±s)

與對照組比較: 1) P＜0.05，2) P＜0.01;與模型組比較: 3) P＜0.05，4) P＜0.01

組別　n　 ROS(ng/L)　 MDA(mol/L)　 LF(μg/g)對照組　20　 23.56±6.01　 5.78±1.46　 54.24±7.45模型組　20　 56.34±8.962)　21.45±2.162)　70.01±8.091)藥線組　20　 32.22±5.23　 16.02±1.74　 63.29±8.55針挑組　20　 29.24±5.863)　7.98±1.873)　53.02±7.853)聯合組　20　 21.04±5.164)　5.64±1.154)　51.22±7.813)

3　討論

D-半乳糖經過半乳糖氧化酶催化生成醛糖和過氧化氫，使機體產生過量的ROS和超氧自由基，超氧自由基具有顯著增強機體內脂質過氧化反應的作用〔5〕，而脂質過氧化反應的主要產物MDA通過交聯蛋白和DNA誘導LF的大量生成，反過來又加重過氧化損傷〔6，7〕，氧化損傷可導致機體細胞功能損害及抗氧化酶如SOD、GSH-Px活性降低，是衰老發生的重要原因。因此，抗氧化與抗衰老是密切相關的，許多延緩衰老的保健方法或保健食品都具有不同程度的抗氧化作用。SOD、GSH-Px活性以及ROS、LF、MDA水平可以反映機體脂質過氧化的程度及機體清除自由基的能力，是抗氧化和抗衰老研究中常用到的指標。SOD和GSH-Px是機體的抗氧化酶，SOD能特異清除體內氧自由基，把氧自由基歧化生成過氧化氫〔12〕，然后通過GSH-Px將過氧化氫轉化為水發揮抗氧化作用，通過檢測SOD和GSH -Px活性可以推知機體抗氧化能力。

研究表明〔8，9〕，針刺和點灸環跳穴、足三里等能提高SOD含量、降低MDA水平，提示針刺和點灸環跳穴、足三里等穴位具有抗氧化損傷的作用。另外有研究顯示〔10，11〕，針刺陽陵泉能提高SOD活性，減輕缺血再灌注和MPTP誘導帕金森大鼠模型新紋狀體的氧化損傷。因此，針刺和點灸環跳穴、足三里、陽陵泉等具有潛在的抗氧化、抗衰老作用〔12〕。本實驗也表明D-半乳糖注射造模已引起模型動物體內氧化損傷，這是衰老發生的重要環節，采用壯醫藥線點灸和針挑療法干預后，ROS、MDA和LF水平均有不同程度的下降，而SOD和GSH-Px活性均有不同程度的升高，以聯合組的表現最明顯。提示壯醫藥線點灸和針挑療法可從提高抗氧化能力、減少氧化產物生成以及增強抗氧化酶活性方面發揮抗衰老作用。

氧化損傷可引起機體細胞功能損害，導致細胞凋亡，從而表現出衰老的特征。近來研究〔13〕顯示端粒酶使細胞壽命延長，端粒酶活性表達高低能夠反映機體抗衰老能力的高低〔14〕。本實驗結果提示藥線點灸和針挑聯用可以增強端粒酶活性而發揮抗衰老作用。

壯醫藥線點灸療法是廣西壯族地區群眾常用的特色療法，壯醫藥理論和實踐已證明其具有溫經通絡止痛的效果，通過疏通“龍路”、“火路”，通行血脈、祛邪外出，達到“天地人”三氣同步、氣血平衡的健康狀態，對慢性疼痛、風濕痹痛等慢性病療效確切。針挑療法同作為壯醫特色療法，壯醫專家黃漢儒〔15〕認為針挑療法的作用機制是挑刺可以激發人體正氣，將郁滯體內的有形或無形之毒從體表針挑點驅出，體現壯醫理論“調氣、祛毒”的治療原則。本實驗探討藥線點灸和針挑療法抗氧化、抗衰老的機制，觀察其作為養生保健方法的可能性，為將其作為新的療養手段提供依據。

4　參考文獻

1滕紅麗.壯醫藥線點灸療法概論〔J〕．遼寧中醫藥大學學報，2010; 12 (1) : 21-2．

2林辰，蔣桂江，陳攀，等.壯醫針刺研究的新進展〔J〕．中國民族醫藥雜志，2011; (5) : 65．

3 Cox LS，Mason PA.Prospects for rejuvenation of aged tissue by telomerase reactivation〔J〕．Rejuvenation Res，2010; 13(6) : 749-54．

4 Lee SW，Clemenson GD，Gage FH.New neurons in an aged brain〔J〕．Behav Brain Res，2012; 227(2) : 497-507．

5 Greiner JF，Müller J，Zeuner MT，et al．1，8-Cineol inhibits nuclear translocation of NF-κB p65 and NF-κB-dependent transcriptional activity〔J〕．Biochim Biophys Acta，2013; 1833(12) : 2866-78．

6 Alpertunga B，Kara M，Abudayyak M，et al．Effects of Prochloraz on Dna Damage，Lipid Peroxidation and Antioxidant System in vitro〔J〕．Toxicol Mech Methods，2014; Epub ahead of print．

7 Cui Y，Han Y，Yang X，et al．Protective Effects of quercetin and quercetin-5＇，8-disulfonate against carbon tetrachloride-caused qxidative liver injury in mice〔J〕．Molecules，2013; 19(1) : 291-305．

8孫遠征，王偉華，毛翔.溫針對大鼠糖尿病周圍神經病變坐骨神經傳導速度及MDA、SOD、TAOC的作用〔J〕．上海針灸雜志，2011; 30 (2) : 134-6．

9孔立紅，陳友梅，郭桂榮，等.針灸對糖尿病大鼠血清SOD及MDA的影響及其比較觀察〔J〕．上海針灸雜志，1998; 17(4) : 42．

10Chen Y，Zhou J，Li J，et al．Electroacupuncture pretreatment prevents cognitive impairment induced by limb ischemia-reperfusion via inhibition of microglial activation and attenuation of oxidative stress in rats〔J〕．Brain Res，2012; 1432: 36-45.

11 Kim ST，Moon W，Chae Y，et al．The effect of electroaucpuncture for 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine-induced proteomic changes in the mouse striatum〔J〕．J Physiol Sci，2010; 60(1) : 27-34．

12Karakiulakis G，Roth M.Muscarinic receptors and their antagonists in COPD: anti-inflammatory and antiremodeling effects〔J〕．Mediators Inflamm，2012; 2012: 409580．

13 Yamada-Fukunaga T，Yamada M，Hamatani T，et al．Age-associated telomere shortening in mouse cocytes〔J〕．Reprod Biol Endocrinol，2013; 11(1) : 108．

14 Boccardi V，Barbieri M，Rizzo MR，et al．A new pleiotropic effect of statins in elderly: modulation of telomerase activity〔J〕．FASEB J，2013; 27 (9) : 3879-85．

15黃漢儒.壯醫理論體系概述〔J〕．中國中醫基礎醫學雜志，1996; 6 (11) : 3-7．

〔2014-09-17修回〕

(編輯李相軍)

通訊作者:鄭建宇(1958-)，女，教授，主任醫師，主要從事針灸臨床與基礎研究。

基金項目:國家自然科學基金項目(No．81360579)

〔中圖分類號〕R244.5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4429-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.005