海馬齒狀回GABAB受體在血管性癡呆大鼠空間學習記憶中的作用

金恩鴻　李光燮　李英順　王　丹　金清華(延邊大學附屬醫院外科，吉林　延吉　33000)

海馬齒狀回GABAB受體在血管性癡呆大鼠空間學習記憶中的作用

金恩鴻李光燮李英順1王丹1金清華1
(延邊大學附屬醫院外科，吉林延吉133000)

〔摘要〕目的探討海馬齒狀回(DG)的GABAB受體是否參與血管性癡呆(VD)大鼠空間學習記憶損害。方法SD雄性大鼠24只，隨機分為假手術組、VD組及GABAB受體阻斷劑沙克洛芬組，雙側頸總動脈永久性結扎法制備VD大鼠模型。利用Morris水迷宮檢測大鼠的空間學習記憶能力;腦部微量透析法和高效液相色譜法測定DG區γ-氨基丁酸(GABA)含量;免疫組織化學法觀察DG區GABAB受體表達;用腦部微量注射法往DG區注射GABAB受體阻斷劑沙克洛芬，觀察其對VD模型大鼠空間學習記憶的影響。結果VD大鼠海馬DG區GABA含量明顯增加，而GABAB受體表達減少(均為P＜0.05)。VD大鼠的空間學習記憶能力顯著下降，而訓練前向DG區微量注射GABAB受體阻斷劑可改善VD大鼠的空間學習記憶損害。結論VD模型大鼠海馬DG內增加的GABA通過GABAB受體參與其空間學習記憶的損害。

〔關鍵詞〕血管性癡呆;海馬齒狀回; GABAB受體;空間學習與記憶

1延邊大學醫學院生理學與病理生理學教研室

第一作者:金恩鴻(1963-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事術后并發癥機制的研究。

Role of GABAB receptors of hippocampal dentate gyrus in spatial learning and memory in vascular dementia rat models

JIN En-Hong，LI Guang-Xie，LI Ying-Shun，et al.
Department of Surgery，Yanbian University Hospital，Yanji 133000，Jilin，China

【Abstract】Objective To investigate whether the GABAB receptors in the hippocampal dentate gyrus(DG) are were involved in spatial learning and memory impairments in vascular dementia(VD)．Methods Totally 24 SD rats were randomly divided into sham－operated，VD and GABAB receptor antagonist groups，and the VD rat model was established by permanent bilateral carotid occlusion．The extracellular concentration of GABA in DG was determined by in vivo microdialysis and HPLC，and spatial learning and memory was assessed by Morris water maze test．The role of GABAB receptors in spatial learning and memory impairments of VD rats was next investigated by microinjection of its antagonists into the DG．Results The extracellular concentration of GABA in DG was increased and the number of GABAB receptor－positive cells in DG was decreased in VD group compared with those of sham－operated group．Spatial learning and memory was impaired in VD group，and microinjection of GABAB receptor antagonist into DG significantly attenuated the spatial learning and memory deficits of VD rats．Conclusions Increased GABA in the hippocampal DG might play a role in spatial learning and memory impairment in VD rats via GABAB receptors．

【Key words】Vascular dementia; Hippocampal dentate gyrus; GABAB receptors; Spatial learning and memory

血管性癡呆(VD)是本文常見的與年齡相關的神經功能障礙〔1〕，海馬是學習記憶的關鍵部位，尤其在空間學習記憶中起重要作用〔2〕。哺乳類海馬齒狀回(DG)作為信息進入海馬的傳入點，對空間信息進行處理和編碼，并在空間學習記憶中起著至關重要的作用〔3〕。研究表明，海馬DG在VD空間學習記憶損害中可能起重要作用〔4〕，但對參與VD空間記憶損害過程的DG內神經遞質及其作用目前尚未完全弄清楚。γ-氨基丁酸(GABA)作為腦內主要的抑制性神經遞質，廣泛存在于中樞神經系統中，海馬DG內也存在大量的GABA能神經元及GABAB受體。雖然研究表明，DG內的GABAB受體參與調節突觸可塑性及某些學習記憶過程〔5〕，但其在VD空間學習記憶損害中的作用尚未見報道。本研究探討海馬DG區GABAB受體在VD模型大鼠空間學習記憶損害中的作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物及VD模型制備健康雄性SD大鼠24只，體重(200±20) g，由延邊大學醫學部實驗動物科提供。動物隨機分假手術組(6只)、VD組(12只)和沙克洛芬(GABAB受體阻斷劑)組(6只)。大鼠腹腔注射10％的水合氯醛(300 mg/kg)進行麻醉，并仰臥位固定于鼠臺，頸部皮膚剪毛備皮、碘伏酒精常規消毒。在大鼠的頸正中線左側旁開0.5 cm處做一個長約1 cm的切口，用玻璃鉤剝離出左頸總動脈，用醫用4號手術絲線雙重結扎，縫合切口。術后每天以碘伏消毒傷口及周圍皮膚。7 d后，于頸正中線右側進行相同手術，結扎右側頸總動脈。假手術組除了不結扎雙側頸總動脈，其余步驟均與VD組相同。各組動物術后單獨飼養1 w后合籠飼養，并從模型制備完成30 d后開始進行下一步實驗。

1.2DG內微量透析探針或微量注射針的埋入大鼠用10％的水合氯醛(300 mg/kg)進行腹腔麻醉，腹臥位固定于腦立體定位儀上，參照Paxinos和Watson大鼠腦圖譜，將外套管插入到DG上1 mm處(前囟向后3.4 mm，正中線旁開2.2 mm，深度2.5 mm)，并用牙托粉固定于顱骨表面。經外套管將自制的微量透析探針或微量注射針垂直插入到DG區，并用蠟固定。微量透析探針超出外套管1.5 mm，其前端有外徑0.2 mm的乙酸纖維素半透膜(DM-22，Eicom，日本)，可濾過分子量小于50 000的物質。微量注射針(外徑0.1 mm)超出外套管1 mm，用于DG區局部微量注射。大鼠回籠飼養，待完全恢復后，在清醒、自由活動狀態下進行微量透析和行為學實驗。

1.3海馬DG的GABA含量測定微量透析探針連接于微量泵(ESP-64，日本Eicom公司)，以1.5 μl/min的速度灌流改良Ringer液(147 mmol/L NaCl，4 mmol/L KCl，2.3 mmol/L CaCl2，pH 6.5)，穩定30 min后，經自動收集器(EAS-20，Eicom，日本)收集微量透析樣本，每管樣本收集10 min，每只動物收集3個管，取平均值。將12 μl的樣本與3 μl的OPA(4 mmol/L)混合，常溫下靜置2.5 min，抽取10 μl的混合液，應用手動進樣器，注入到生物活性物質微量分析系統(HTEC-300，Eicom，Japan)內，以0.5 ml/min的速度通過高效液相色譜分離柱(SC-50DS，Eicom，Japan)和電化學檢測器(ECD-300，Eicom，Japan)，測定各個樣本中GABA濃度。

1.4Morris水迷宮(MWM)檢測利用MWM觀察大鼠的空間學習記憶能力，包括定位航行試驗和空間探索試驗。MWM檢測時，水池中水深約45 cm，水溫保持在(22±2)℃，直徑10 cm的圓形平臺放于任一象限(此象限定為目標象限)的中心位置，并淹沒于水面下約2 cm。定位航行試驗時，將大鼠在固定位置面向池壁放入水中，若大鼠在120 s內找到站臺，則以找到站臺并四肢爬上站臺時所需的時間作為逃避潛伏期;若大鼠在120 s內未找到站臺，則將其引至站臺并停留15 S，潛伏期記為120 s。大鼠在站臺停留15 s后，將其送回飼養籠中，注意保溫。大鼠每天訓練一次，連續訓練4 d。水迷宮檢測第5天進行空間探索試驗，即撤去水池中的圓形平臺，從同一個入水點將實驗動物放入水中，測量大鼠在120 s內穿越原站臺象限的次數。

1.5免疫組化法檢測DG區GABAB受體的表達腹腔注射10％水合氯醛，進行深度麻醉，夾閉腹主動脈，經升主動脈插管，先后用4℃的生理鹽水500 ml和4％多聚甲醛500 ml灌注，先快后慢，同時右心室放血。直到四肢痙攣黏膜變白，取腦組織，浸入4％多聚甲醛中，固定2 h后，20％蔗糖溶液中過夜直至下沉，后置于30％蔗糖溶液中過夜，4℃冷藏。將包含海馬DG區的腦組織用OCT冷凍包埋，連續冠狀切片，厚度10 μm，隔三取一，晾干備用。切片在100％冷丙酮4℃固定10 min，依次加入兔抗鼠GABAB受體抗體(稀釋度1∶1 000，4℃過夜)和山羊抗兔IgG(稀釋度1∶200，37℃2 h)后，DAB顯色5 min，最后沖洗脫水，中性樹膠封片并拍照分析。期間常規沖洗用0.01 mol/L的PBS(pH 7.4)溶液，而陰性對照以PBS溶液替代一抗。陽性反應產物呈黃褐色，在每只大鼠隨機取10張切片，并在光鏡下隨機選擇DG區相應部位的5個視野(×400)，進行GABAB受體陽性細胞計數。

1.6藥物的DG區微量注射GABAB受體阻斷劑沙克洛芬(Saclofen，美國Sigma公司)用改良Riger液配成0.05 μg/μl溶液。每日進行水迷宮訓練之前，微量注射針連接微量注射泵，以1 μl/min的速度向海馬DG區注射1 μl的沙克洛芬或改良Riger液，注入時程為1 min，滯留1 min，30 min后開始進行MWM訓練。

2　結果

2.1VD大鼠空間學習記憶能力的變化在4 d的MWM定位航行試驗中，假手術組與VD組大鼠找到站臺所需的逃避潛伏期均隨著訓練天數的增加而逐漸縮短，但VD組的第1天和第4天的逃避潛伏期明顯長于假手術組(均為P＜0.05) ;整個訓練期間的平均逃避潛伏期，VD組為(28.84±3.02) s，對照組為(43.21±4.20) s，兩組間差異顯著(P＜0.05) ; VD模型組穿越原站臺區的次數明顯少于假手術組(P＜0.05)。見表1。

2.2VD大鼠海馬DG區GABA含量及GABAB受體表達的變化VD組大鼠海馬DG區細胞外液中的GABA濃度為(0.78± 0.11)μmol/L，明顯高于未進行頸總動脈結扎術的假手術組(0.15±0.01)μmol/L(P＜0.05)。與假手術組(39.50±3.20)相比，VD組大鼠海馬DG區的GABAB受體陽性細胞數(31.85± 2.53)明顯減少(P＜0.05)。

2.3海馬DG區微量注射沙克洛芬對VD大鼠空間學習記憶能力的影響在4 d的定位航行試驗中，沙克洛芬組和對照組的大鼠逃避潛伏期均隨著訓練天數的增加而逐漸減少，而第4天的逃避潛伏期兩組間有顯著性差異(P＜0.05) ;整個訓練期間的平均逃避潛伏期，沙克洛芬組為(35.13±3.06) s，對照組為(50.99±3.34) s，兩組間差異顯著(P＜0.05)，見圖1。訓練第5天的空間探索試驗結果顯示，沙克洛芬組的穿越原站臺區的次數〔(10.14±1.71)次/120 s〕明顯多于對照組〔(5.03±1.65)次/ 120 s〕(P＜0.05)。

表1　各組大鼠逃避潛伏期和穿越原站臺區次數比較(±s，n=6)

表1　各組大鼠逃避潛伏期和穿越原站臺區次數比較(±s，n=6)

與假手術組比較: 1) P＜0.05

組別逃避潛伏期(s) 第1天　　第2天　　第3天　　第4天穿越原站臺區次數(次/120 s)假手術組　53.75±4.92　36.87±6.83　19.53±1.83　11.43±3.17　9.83±1.03 VD組　74.93±5.811)　41.82±7.52　26.64±2.82　24.13±2.961)　5.33±1.011)

圖1　Morris水迷宮定位航行試驗的逃避潛伏期

3　討論

海馬是學習記憶相關的重要區域，也是局部缺氧/缺血等因素造成腦損傷的好發部位。海馬主要亞區包括DG區、CA3區和CA1區，其中DG區在海馬記憶形成過程中起關鍵作用，外部信息投射至此，該區將其整合成片段記憶傳遞。研究表明，缺血時海馬內新生神經元的發生主要在DG區，進而減弱小鼠局灶性腦缺血的空間記憶障礙〔6〕，而損傷大鼠海馬DG區可出現空間記憶的再現障礙〔7〕。GABA是腦內重要的抑制性神經遞質，海馬DG內存在大量的GABA能中間神經元〔8〕;不僅如此，DG與內嗅皮層之間存在長距離的GABA能神經元的相互投射，而這些遠程投射的GABA能纖維可以調節目標區域的中間神經元活動，進而參與空間學習記憶的信息的編碼過程〔9〕。本實驗結果也提示DG內GABA含量的增加可能是VD大鼠空間學習記憶損害的原因之一。

神經遞質的作用離不開受體，GABA能受體主要分為GABAA，GABAB以及GABAC三類，海馬內以促離子型GABAA和促代謝型GABAB為主。研究表明，阻斷DG內的GABAB受體可抑制長時程增強(LTP)的形成，并損害應激狀態下的空間學習過程〔10〕，而DG內的GABAB受體是否參與VD學習記憶障礙目前尚未見報道。Deng等〔11〕報道，激活GABAB受體可抑制AC-cAMP-PKA途徑，進而減弱PKA對TREK-2通道的抑制，導致神經元興奮性下降并抑制空間學習。因此，我們推測，VD大鼠海馬DG區內增加的GABA可通過GABAB受體抑制DG區主神經元的興奮性，進而損害VD大鼠的空間學習記憶。本實驗結果還顯示，DG區GABAB受體的表達減少，這可能是因VD大鼠海馬DG區GABA含量明顯增加而導致的代償性變化。雖然本實驗結果提示VD大鼠海馬DG區內增加的GABA通過激活GABAB受體參與VD的空間學習記憶損害，但其具體的機制有待進一步研究。

4　參考文獻

1 Román GC.The Epidemiology of vascular dementia〔J〕．Hand Clin Neurol，2008; 89: 639-58.

2 Squire L.Memory and the hippocampus: A synthesis from findings with rats，monkeys，and humans〔J〕．Psychol Rev，1999; 99(2) : 195-231.

3 Kana O，Hiroshige O.Functional differentiation and cooperation among the hippocampal subregions in rats to effect spatial memory processes〔J〕．Behav Brain Res，2009; 200(1) : 181-91.

4王緒平，陳宇，鄭純威，等.Morris水迷宮實驗評價血管性癡呆大鼠模型的學習記憶能力〔J〕．中華中醫藥學刊，2013; 31(1) : 99-101.

5 Shahidi S，Komaki A，Mahmoodi M.The role of GABAergic transmission in the dentate gyrus on acquisition，consolidation and retrieval of an inhibitory avoidance learning and memory task in the rat〔J〕．Brain Res，2008; 1204(14) : 87-93.

6 Li WL，Cai HH，Wang B，et al.Chronic fluoxetine treatment improves ischemia-induced spatial cognitive deficits through increasing hippocampal neurogenesis after stroke〔J〕．Neurosci Res，2009; 87(1) : 112-22.

7 Jeltsch H，Bertrand F，Lazarus C，et al.Cognitive performances and locomotor activity following dentate granule cell damage in rats: role of lesion extent and type of memory tested〔J〕．Neurobiol Learn Mem，2001; 76 (1) : 81-105.

8 Ribak CE.Local circuitry of GABAergic basket cells in the dentate gyrus 〔J〕．Epilepsy Res，1992; 7(1) : 29-47.

9 Melzer S，Michael M，Caputi A，et al.Long-range-projecting GABAergic neurons modulate inhibition in hippocampus and entorhinal cortex〔J〕．Science，2012; 335(6075) : 1506-10.

10 Brucato FH，Levin ED，Mott DD，et al.Hippocampal long-term potentiation and spatial learning in the rat: effects of GABAB receptor blockade 〔J〕．Neuroscience，1996; 74(2) : 331-9.

11 Deng PY，Xiao ZY，Yang CX，et al.GABAB receptor activation inhibits neuronal excitability and spatial learning in the entorhinal cortex by activating TREK-2 K+Channels〔J〕．Neuron，2009; 63(2) : 230-43.

〔2014-11-15修回〕

(編輯李相軍)

通訊作者:金清華(1971-)，女，博士，教授，博士生導師，主要從事神經生理學研究。

基金項目:國家自然科學基金(31160211) ;延邊大學自然科學基金(602013110)

〔中圖分類號〕R749

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4439-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.009