高表達微小RNA22對結腸癌細胞HCT-116增殖的影響

李　博　宋　燕　李春生(吉林大學中日聯誼醫院結直腸肛門外科，吉林　長春　130033)

高表達微小RNA22對結腸癌細胞HCT-116增殖的影響

李博宋燕李春生
(吉林大學中日聯誼醫院結直腸肛門外科，吉林長春130033)

〔摘要〕目的探討高表達微小RNA(mir) -22對結腸癌細胞系(HCT-116)增殖的影響及mir-22水平與結腸癌細胞增殖能力的相關性。方法合成mir-22基因序列，構建SD13-hsa-mir-22質粒，質粒提取后完成對大腸癌細胞系HCT-116細胞的轉染，確認轉染效率后進行Realtime PCR檢測，確定高表達模型建立成功。將HCT-116細胞分為高表達mir-22組、空載體轉染(NC)組及未經處理的HCT-116組。通過四甲基偶氮唑藍比色(MTT)法檢測細胞生長，將測定結果進行統計學分析。結果MTT實驗轉染高表達mir-22的HCT116細胞和轉染空載體的細胞及未轉染的陰性對照組細胞相比，生長速度明顯減慢。而轉染空載體組及陰性對照組細胞生長速度無明顯差距。結論Mir22抑制結腸癌細胞系HCT-116的增殖。

〔關鍵詞〕微小RNA22;結腸癌;增殖

第一作者:李博(1980-)，男，博士，主治醫師，主要從事結直腸癌基礎及臨床研究。

大腸癌是導致人類死亡最致命的殺手之一，大腸癌細胞的擴增能力被證明與多種靶基因相關，而微小RNA(mir) -22具有與多個靶點基因相結合從而控制腫瘤進展的能力，已證明它在乳腺癌、肺癌、肝癌中能夠抑制腫瘤的進展。本實驗擬采取對大腸腫瘤細胞株(HCT-116)轉染mir-22，從而建立高表達模型，明確mir-22水平變化對大腸癌細胞擴增能力的影響。國內外文獻檢索尚未發現mir-22水平與結腸癌細胞增殖能力的相關性報道。

1　材料與方法

1.1細胞株和試劑人類結腸癌細胞系HCT-116購自中國科學院組織標本庫，培養在含有10％胎牛血清的MCCOY’S 5A培養基中，補充青霉素100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml。于37℃，5％的CO2條件下進行培養。Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，質粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，miRNA cDNA Synthesis Kit(Perfect Real Time)試劑盒、RNAiso for Small RNA、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)均購自Takara公司。

1.2主要儀器Realtime PCR測定應用Applied Biosystems公司的ABI PRISM?7300 Real-Time PCR System完成，噻唑藍法(MTT)吸光值測定應用美國BioTek公司的ELx800吸收光酶標儀。

1.3Mir-22載體構建目的基因由miRBase下載人類MicroRNA22基因序列(hsa-miR-22序列5＇-AGUUCUUCAGUGGCAAGCUUUA-3＇)后送invitrogen合成。建立高表達載體，名稱為SD13，克隆片段大小233 bp，上游克隆酶切位點BamH I，下游克隆酶切位點CIP，室溫下進行退火反應形成雙鏈寡核苷酸，用過T4 DNA鏈接酶將hsa-miR-22克隆至SD13載體中，目的質粒名稱SD13-hsa-mir-22。

用CaCl2轉化法制備新鮮的大腸桿菌感受態細胞，將感受態大腸桿菌從－70℃冰箱中取出，在冰上融15 min，融化后輕輕混勻。用移液器吸取50 μl大腸桿菌及5 μl質粒，放入1.5 ml離心管中。混勻后放在冰上30 min。在42℃水浴中熱休克細菌45 s，立即轉移至濕冰中，放置2 min。加入900 μl LB培養液，放入37℃搖床中搖晃培養1 h。在含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上涂上50 μl上述液體，將瓊脂面向上蓋向下的放在37℃的孵箱中過夜，并在第2天取出并放入4℃冰箱。

SD13-hsa-mir-22質粒構建成功后，將陽性轉化子培養并保存為甘油菌，送檢測序。

1.4質粒提取mir-22質粒的提取過程嚴格按照TIANGEN無內毒素質粒大提試劑盒的規定步驟逐步完成。提取出的質粒DNA應用紫外分光光度法進行OD260的測量確定產量，并應用瓊脂糖凝膠電泳法進行分析。然后將mir-22質粒DNA放入－20℃冰箱中進行保存。

1.5細胞轉染取對數生長期細胞，以4×104個細胞/孔的密度鋪于24孔板培養，當細胞生長到70％進行轉染，于1.5 ml無菌EP管內，將5 μl轉染質粒與45 μl無血清無雙抗的MCCOY’S 5A培養基混勻;同樣方法將5 μl轉染試劑(Lipofectamine 2000美國Invitrogen)與45 μl無血清無雙抗的MCCOY’S 5A培養基混勻;將兩支EP管靜置5 min后將管內溶液移至同一EP管內，混勻后室溫放置20 min，最后加入含血清和雙抗的MCCOY’S 5A培養液100 μl，混勻后待用。將鋪板細胞分為轉染mir-22組，空質粒轉染組(NC組)，第三組為空白對照組(不加轉染試劑)。棄去原24孔板培養液，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，緩慢將上述含轉染試劑及質粒的培養液200 μl加入24孔板的相應孔內，將24孔板置于37℃，5％CO2培養箱中孵育。4 h后棄去培養液，200 μl PBS沖洗2次，加入含血清、雙抗的MCCOY’S 5A新鮮培養液400 μl，37℃，5％CO2培養箱中繼續培養。轉染48 h后檢測熒光素酶活性(奧林巴斯熒光顯微鏡SZ61GFP/T-S)，每組實驗重復3次。

1.6Realtime PCR miRNA提取過程取長滿細胞的細胞培養瓶，倒出細胞培養液，PBS清洗1次。培養瓶中加入1.0 ml的RNAiso for Small RNA，水平放置，室溫孵育8 min，用移液槍吹打細胞使其脫落，并將其轉移至1.5 ml的EP管中。加入0.2 ml氯仿，振蕩混勻15 s，室溫孵育5 min。置于預冷好的離心機中，12 000 r/min 4℃離心15 min。離心后在試管中將出現3個可見的層次，將上層無色的水相轉移至一個新的EP管中，并注意不被其他層污染。向上清中加入0.5 ml異丙醇，混合后室溫靜置10 min，在4℃及12 000 r/min下離心10 min，可見少量沉淀物。移除上清液，并加入75％的乙醇1 ml，4℃、12 000 r/min離心5 min，之后移除乙醇。在室溫下使沉淀干燥，蒸發殘存乙醇5 min，用碳酸二乙酯(DEPC)水30 μl溶解，并加入RNA酶抑制劑1 μl，至RNA沉淀完全溶解后－80℃保存備用。

miRNA反轉錄:應用Takara公司生產的SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)試劑盒，采取20 μl反應體系進行反轉錄反應，應用Gene Specific Primer 5 pmol /20 μl，反轉錄反應條件設置為42℃15 min。將miRNA反轉錄生成cDNA。

PCR反應液配制:應用Takara公司生產的One Step Prime-Script?miRNA cDNA Synthesis Kit(Perfect Real Time)試劑盒，選用20 μl反應體系進行配制。分別選用micr22及U6進行反應分析，上游及下游引物均購自廣州銳博公司，hsa mir-22的PCR產物片段為88 bp，U6的PCR產物片段為96 bp。

應用分光光度計測定cDNA濃度，將加樣前的cDNA濃度均進行相當倍數的稀釋，使其濃度統一，使20 μl反應液中使用相當于100 ng Total DNA量的cDNA為模板。

進行Real Time PCR反應:應用Applied Biosystems公司生產的ABI PRISM?7300 Real-Time PCR System進行反應，反應結束后應用7300 System SDS Software進行數據分析，確認標準曲線，應用U6制作標準曲線，因miRNA片段較小，應用U6作為內參照。反應最終產物可進行電泳分析。

把cDNA按照10倍稀釋，設定6個濃度梯度，分別為1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5進行Realtime PCR擴增，以標準品U6繪制標準曲線。

1.7MTT法檢測細胞生長胰酶消化懸浮細胞后行細胞計數，培養液稀釋細胞懸液，以每孔10 000個細胞接種到96孔板，每孔體積200 μl。將每個96孔板鋪三組細胞，每組鋪三個孔，分別進行mir-22、NC轉染及空白對照，熒光顯微鏡下確認轉染成功后，37℃，5％CO2培養箱中培養2 d，取一塊96孔板，每孔加MTT溶液20 μl，繼續孵育4 h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，每孔加150 μl二甲基亞砜(DMSO)，脫色搖床震蕩10 min，使結晶物充分溶解。選擇490 nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果。每天檢測1塊96孔板，每組3孔取平均值，連續檢測1 w的生長情況，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.8統計學方法應用SPSS13.0軟件行t檢驗和方差分析。

2　結果

2.1質粒測序應用Chromas分析測序結果，可找到人類Mir22基因序列(hsa-miR-22序列5＇-AGUUCUUCAGUGGCAAGCUUUA -3＇)，證實高表達載體建立成功。

2.2轉染效率檢測轉染48 h后檢測熒光素酶活性，確定轉染效率達到85％。見圖1。

2.3Realtime PCR檢測標準曲線及溶解曲線擴增效率E= 0.948 9，相關系數r2=0.993 5，標準曲線線性關系良好，在實驗濃度范圍內能夠進行準確定量。無論哪一種濃度的U6都能得到單一的PCR擴增的產物。

2.4定量PCR檢測mir-22表達HCT-116細胞的mir-22的表達量較低，轉染mir-22組細胞的表達量為(22.12±0.04)。NC組為(26.92±0.07)、未經處理的HCT-116組為(26.65± 0.06) (P＜0.05)。且U6分別為11.78±0.09，11.05±0.06，10.39±0.15，已知hsa mir-22的PCR產物片段為88 bp，U6的PCR產物片段為96 bp，電泳結果進一步驗證了PCR產物。

2.5MTT檢測細胞生長轉染高表達mir-22的HCT-116細胞和NC組細胞及HCT-116組細胞相比，生長速度明顯減慢。而NC組HCT-116組細胞生長速度無明顯差距。見表1。

圖1　轉染效率熒光素酶檢測

表1　高表達mir-22對結腸癌細胞系HCT-116增殖能力的影響(±s)

表1　高表達mir-22對結腸癌細胞系HCT-116增殖能力的影響(±s)

組別　　第1天　　第2天　　第3天　　第4天　　第5天　　第6天　　第7天mir-22組　1.159±0.006 1　 1.165±0.012 3　 1.261±0.054 6　 1.293±0.027 1　 1.322±0.029 3　 1.452±0.018 8　 1.529±0.010 1 NC組　1.161±0.005 3　 1.625±0.037 0　 1.888±0.046 5　 2.508±0.030 5　 2.934±0.047 4　 3.121±0.028 0　 3.269±0.047 0 HCT-116組　1.156±0.027 6　 1.665±0.048 1　 1.949±0.026 0　 2.707±0.065 5　 2.994±0.073 7　 3.171±0.075 5　 3.278±0.016 6

3　討論

人類mir22是新近發現的由22個核苷酸組成的非編碼蛋白RNA，染色體位置在17p13.3，具有抑癌特性。在傳統意義上有三種不同的基因涉及惡性腫瘤的形成過程中:癌基因、抑癌基因和基因組穩定基因。很多學者認為這些基因都是有蛋白編碼基因構成。然而，越來越多的證據表明，miRNA在腫瘤的發生、發展過程中起到了重要作用，可以將它們看作是促癌基因或抑癌基因，或者更為復雜的作用方式。與很多miRNA的促癌作用不同，mir22表現出了抑癌基因般的作用效果，對多種腫瘤都展現出了調控能力。而且在胚胎發育、骨骼代謝、心肌細胞發育等方面，miRNA也展現出了極為重要的地位。但其具體的作用途徑、作用位置和作用靶點都有待我們進一步探索。

在心血管疾病方面，已經有人通過研究mir22基因區域的rs7223247 SNP，證實了其表達與左心室重量增加存在相關性〔1〕。還有人證明過表達mir22能夠顯著促進新生的心臟成纖維細胞提前成熟〔2〕。在神經系統方面，Mui?os-Gimeno等〔3〕指出miR-22與恐慌癥有關，并且調控了一些與焦慮相關的基因。更有人對亨廷頓氏病進行研究，發覺過表達mi22能夠阻止神經細胞凋亡并起到神經保護作用，并可能是通過影響亨廷頓氏病的通路產生作用〔4〕。在胚胎發育系統方面，mir22能夠降低未分化肝細胞胸腺旁腺素的分泌，也能通過控制Irf8 mRNA來影響鼠類樹突細胞的分化〔5〕。

骨骼代謝方面，上調mir22能夠通過抑制HDAC6蛋白的表達，促進成骨細胞的分化〔6〕。而在婦科系統中，子宮內膜異位癥的患者被證明血漿中的mir-22呈下調表現〔7〕。在研究不斷深入的過程中，有人發現了mir-22通過轉錄后修飾ErbB3，從而抑制了肺癌細胞系A549和H1299的增殖和侵襲能力〔8〕。對于乳腺癌細胞，有人提出mir-22可以直接作用于ERα從而阻止了雌激素信號途徑，抑制了腫瘤細胞的生長〔9〕。也有人認為，mir-22通過調控EVI-1癌基因的表達，從而起到了抑制乳腺轉移癌的目的〔10〕。在肝癌領域，mir-22的目的基因是HDAC4，能夠通過抑制HDAC4達到抑制HCC細胞系擴增的目的〔11〕。同時，也能夠通過抑制核轉錄因子(NF) -κB活化劑的表達，抑制肝癌生成〔12〕。對于卵巢癌的研究更為透徹，mir-22被認為能夠在侵襲和遷移層面發揮抑制作用，更進一步是其抑制作用通過Tiam1起效〔13〕。

證據表明，mir-22的表達改變在不同癌癥的進展中起著重要作用，然而，mir-22在結腸癌細胞中的確切作用仍不明確。之前有文獻報道在缺氧狀態下，mir-22可以通過抑制結腸癌細胞翻譯缺氧誘導因子(HIF) -1α，從而發揮其抑癌作用〔14〕，然而，本實驗是在供氧充分的環境下完成的，用HIF-1似乎無法解釋HCT-116細胞所帶來的變化。這項研究表明，mir-22的調控機制仍然存在疑點，需要進一步探索。

Mir-22已經被廣泛在體內和體外進行不同類型的人類癌癥研究。但很少有報道指出它在結腸癌中的作用。mir-22在很多脊椎動物中序列高度保守。早期的研究表明，mir-22在紅細胞成熟過程中起到重要作用〔15〕;近期的數據表明，mir-22在不同種類的腫瘤發生過程中都出現了表達水平的變化。因此，它被認為能夠作為一種人類腫瘤的抑癌基因。已有研究將結腸癌組織和臨近正常腸黏膜組織進行對比分析，發現在結腸癌組織中mir-22的相對表達水平要明顯低于臨近正常的黏膜組織〔16〕。這又從組織實驗的角度證實了mir-22和HCT-116的惡性行為程度呈逆向變化。然而，mir-22在結腸癌中的具體作用機制仍是未知的。由于miRNA的作用特點是可以同時對人體的多個基因位點進行調控，而動物的miRNA和mRNA之間的互補程度比較低，這樣就增加了動物的靶基因預測出現假陽性的可能性，研究其作用方式比較困難。因此，只有找到它在結腸癌細胞中所調控的基因位點才能進一步推測它在腫瘤的發生、發展中所起到的作用過程。

總之，miR-22可能在未來能夠對結腸癌進展的控制發揮重要作用。

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〔2015-02-11修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者:宋燕(1954-)，女，教授，博士生導師，主要從事結直腸癌基礎及臨床研究。

基金項目:吉林省青年科研基金項目資助課題(No．20150520146JH)

〔中圖分類號〕R753.3+5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4447-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.012