DC-CIK療法聯(lián)合細胞因子對老年乳腺癌患者外周血CD4+CD25+Tr細胞水平和免疫功能的影響

趙　芳　張　?！ⅰ§o　王建華　王　娟(滄州市中心醫(yī)院，河北　滄州　061000)

DC-CIK療法聯(lián)合細胞因子對老年乳腺癌患者外周血CD4+CD25+Tr細胞水平和免疫功能的影響

趙芳張睿劉靜王建華王娟
(滄州市中心醫(yī)院，河北滄州061000)

〔摘要〕目的探討樹突細胞-細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(DC-CIK)療法聯(lián)合細胞因子對老年乳腺癌患者外周血CD4+CD25+Tr細胞水平和免疫功能的影響。方法應(yīng)用流式細胞儀檢測23例老年乳腺癌患者，經(jīng)DC-CIK細胞治療聯(lián)合細胞因子治療前后外周血中CD4+CD25+Tr細胞水平。結(jié)果治療前CD4+CD25+Tr細胞水平明顯高于健康對照組(P＜0.05)。治療后DC-CIK治療組和DC-CIK療法聯(lián)合細胞因子組均明顯低于健康對照組和治療前(P＜0.05) ; DC-CIK療法聯(lián)合細胞因子組降低更為明顯。隨著培養(yǎng)時間的延長，CIK細胞中CD3+CD8+、CD3+CD56+細胞的百分含量明顯上升。治療后，患者外周血T細胞亞群水平均升高，其中CD3+、CD4+、CD19+、CD16+CD56+細胞水平明顯高于治療前(P＜0.05)。結(jié)論老年乳腺癌患者處于免疫功能的抑制狀態(tài)，接受DC-CIK細胞聯(lián)合細胞因子的治療后，CD4+CD25+Tr細胞水平降低，患者機體的免疫功能明顯提升。

〔關(guān)鍵詞〕乳腺癌; DC-CIK療法; CD4+CD25+Tr細胞;免疫功能

第一作者:趙芳(1980-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事惡性腫瘤的DC-CIK細胞免疫治療。

乳腺癌是老年女性常見的惡性腫瘤之一，治療方案主要包括手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療。近年來，隨著生物免疫治療的進展，乳腺癌的生物免疫治療逐漸興起，其包括主動性免疫治療和被動性免疫治療。過繼性免疫治療是被動免疫的一種，在近幾年的基礎(chǔ)及臨床研究中取得突破性進展〔1〕。過繼免疫治療包含淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)、腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)、特異性細胞毒T淋巴細胞(CTL)、樹突細胞(DC)、細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(CIK)等，其中，DC細胞、CIK細胞治療為近年的研究熱點〔2〕。本研究應(yīng)用流式細胞儀檢測了老年乳腺癌患者接受DC-CIK細胞免疫治療前后CD4+CD25+Tr細胞和各抗腫瘤相關(guān)免疫因子表達水平，旨在為老年乳腺癌患者新的細胞免疫治療提供參考。

1　材料與方法

1.1研究對象選取2010年5月至2013年10月本院腫瘤診療中心收治的老年乳腺癌患者23例，均經(jīng)術(shù)后病理活檢確診，且在接受常規(guī)化放療后無法耐受繼續(xù)治療。年齡60～70〔平均(63.19±2.17)〕歲;隨機分為DC-CIK治療組(11例)和DC-CIK療法聯(lián)合細胞因子組(12例) ;選取同期來本院體檢的23名健康人為對照組。入選者及其授權(quán)委托人均充分知情同意，并在細免疫治療同意書中簽字。

1.2儀器與試劑流式細胞儀(美國BD公司) ;血細胞分離機(德國費森尤斯公司) ;倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯) ; MCO-15AC型細胞孵育箱(日本三洋公司)。Ficoll淋巴細胞分離液(密度1.077 g/ml，購于天津灝洋生物有限公司) ; DMEM細胞培養(yǎng)液(美國Gibco公司) ; CD3單抗(武漢生物制品研究所) ;γ-干擾素(上?？寺∩锔呒夹g(shù)有限公司)。

1.3細胞培養(yǎng)分離患者外周血單個核細胞約3×109，去漿、Ficoll淋巴細胞分離液分離單個核細胞，用細胞培養(yǎng)液洗滌2次，離心后加入細胞培養(yǎng)瓶中，放入CO2孵育箱中培養(yǎng)2 h后將懸浮細胞移入另外培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)CIK細胞，瓶中遺留的貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)DC細胞，每3天換液1次，第4天加入腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素(IL) -4、GM因子，作DC細胞的常規(guī)誘導(dǎo)，懸浮細胞則調(diào)整細胞濃度為2×106/ml，加入CD3單抗，γ-干擾素2 000 U/ml，計為第0天，之后第1天加入1 000 U/ml IL-2誘導(dǎo)CIK細胞，換液當天觀察細胞，初步評判細胞的生長狀態(tài)，隔3 d換液1次，加入等量的γ-干擾素、IL-2，同時抽取細菌、真菌培養(yǎng)，換液后繼續(xù)放回孵育箱中。

1.4培養(yǎng)細胞的回輸培養(yǎng)細胞的回輸:細胞培養(yǎng)第11～15天，采用流式細胞儀檢測，當CD3+CD56+細胞數(shù)≥50％，CD3+CD8+細胞≥30％，并且同時留取細菌及真菌培養(yǎng)陰性時方可收集細胞。應(yīng)用1％～2％蛋白生理鹽水1 500 r 15 min洗滌3次，收集細胞加入1％蛋白生理鹽水中回輸，一般為每日回輸一次，一個療程根據(jù)患者細胞生長的總量回輸5～7次，回輸細胞總數(shù)約10×109/L。回輸當天另建液路，末次輸注過程中在患者床旁觀察，同時觀察每次輸注后1 d內(nèi)患者狀態(tài)。根據(jù)患者病情及調(diào)節(jié)性T細胞的水平，決定患者的DC-CIK細胞免疫治療的分組，11例患者單純應(yīng)用DC-CIK細胞，12例患者在細胞培養(yǎng)過程中及細胞輸注后配合細胞因子治療，給予100萬單位IL-2肌注，隔日1次，300萬單位α-2b干擾素肌注，隔日1次，30～40 d 為1個療程。

1.5細胞鑒定和T細胞亞群檢測細胞鑒定:分別于細胞培養(yǎng)第0、7、13、15天，采用流式細胞儀測定細胞免疫表型，取培養(yǎng)的細胞液1 ml，分別加入20 μl鼠抗人抗體，充分混勻，閉光條件下孵育40 min，4℃、3 000 r/min離心10 min，沖洗、過濾后加入磷酸鹽緩沖液(PBS) 400 μl，采用流式細胞儀進行檢測。T細胞亞群檢測:分別于治療前后采集外周靜脈血2 ml加入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，加入20 μl鼠抗人抗體，混勻，閉光條件下孵育30～40 min，4℃、3 000 r/min離心10 min，沖洗、過濾后加入PBS緩沖液400 μl，采用流式細胞儀進行檢測。

1.6統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)以±s表示。

2　結(jié)果

2.1不良反應(yīng)情況5例患者首次接受細胞治療后2 h以內(nèi)即出現(xiàn)發(fā)熱，體溫最高38.0℃，囑患者多飲用溫開水后汗出，患者在細胞輸注結(jié)束后10 h體溫均降至正常。18例患者靜脈輸注過程順利無反應(yīng)，第2次細胞回輸后發(fā)熱癥狀明顯緩解，患者治療耐受性均良好。

2.2治療情況比較治療前CD4+CD25+Tr細胞水平明顯高于健康對照組(P＜0.05)。治療后DC-CIK治療組和DC-CIK療法聯(lián)合細胞因子組(5.89±2.69、3.67±1.56)，均明顯低于對照組(9.03±1.53)，且低于治療前(P＜0.05) ;其中DC-CIK療法聯(lián)合細胞因子組患者CD4+CD25+Tr細胞水平降低更為明顯。

2.3細胞培養(yǎng)過程中細胞免疫表型的變化情況CIK細胞屬于異質(zhì)細胞群，隨著培養(yǎng)時間的延長，CIK細胞中CD3+CD8+、CD3+CD56+細胞的百分含量明顯上升。見表1。

表1　細胞培養(yǎng)過程中細胞免疫表型的變化(±s，％)

表1　細胞培養(yǎng)過程中細胞免疫表型的變化(±s，％)

與第0天相比: 1) P＜0.01

培養(yǎng)時間　CD3+CD8+　CD3+CD56+第0天　19.18±2.35　7.08±2.36 第7天　39.78±4.241)　30.28±4.461)第13天　41.04±4.771)　33.08±2.471)第15天　53.57±5.091)　40.76±4.541)

2.4患者外周血T細胞亞群的變化情況治療后DC-CIK治療組和DC-CIK療法聯(lián)合細胞因子組患者外周血T細胞亞群水平均升高，其中CD3+、CD4+、CD19+、CD16+CD56+細胞水平明顯高于治療前(P＜0.05)。見表2。

表2　治療前后患者T細胞亞群的變化(±s，％)

表2　治療前后患者T細胞亞群的變化(±s，％)

與治療前相比: 1) P＜0.05

T細胞亞群　　治療前　　治療后CD3+　50.78±6.31　70.21±1.891)CD4+　20.89±2.61　37.18±5.751)CD8+　29.56±4.01　30.13±6.01 CD19　8.13±1.98　23.45±3.671)CD16+CD56+　15.21±3.78　38.23±6.951)

3　討論

腫瘤局部存在多種的免疫抑制細胞，它們參與腫瘤患者的細胞免疫，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密不可分。對于腫瘤患者外周血中CD4+CD25+Tr細胞水平的研究日漸深入，因其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及其機體抗腫瘤免疫中發(fā)揮的作用日趨明朗，對其進一步深入研究和開發(fā)將為多種T細胞介導(dǎo)的治療，尤其是抗腫瘤免疫提供了一種全能、高效的臨床治療方案。

DC細胞是有效的抗原提呈細胞，特征性的高表達與抗原遞呈有關(guān)的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ類和Ⅱ類分子，并且高水平表達刺激分子CD80、CD86、CD40、CD50等，以及某些黏附分子，其本身也可以產(chǎn)生多種細胞因子〔3〕。CIK細胞是以CD3+CD56+T細胞為主的異質(zhì)細胞群，是新型的抗腫瘤效應(yīng)細胞，兼具T淋巴細胞和自然殺傷(NK)細胞的抗腫瘤特性，與以往的抗腫瘤效應(yīng)細胞相對比，CIK細胞的抗腫瘤效應(yīng)更強〔4〕。DC與CIK細胞在抗腫瘤中有一定的互補作用，為取得較好的療效可聯(lián)合使用。老年患者乳腺癌惡性程度較高，往往常規(guī)的放化療均不能耐受，嘗試采用抗腫瘤免疫的生物治療模式〔5〕。本次治療中僅有5例患者在應(yīng)用回輸CIK細胞過程中出現(xiàn)低熱反應(yīng)，這種低熱原因其一考慮為回輸?shù)腃IK細胞中包含人血白蛋白及細胞因子IL-2，其二考慮同DC細胞聯(lián)合CIK細胞治療后大量的細胞因子釋放作用于患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)引發(fā)的上調(diào)體溫調(diào)節(jié)中樞導(dǎo)致的發(fā)熱反應(yīng)。

CD4+CD25+Tr細胞為一系列重要的免疫調(diào)節(jié)細胞，由于其在預(yù)防發(fā)生自身免疫病的同時，可上調(diào)免疫效應(yīng)細胞的活化閾值，抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，導(dǎo)致機體對早期腫瘤常表現(xiàn)為一種無反應(yīng)狀態(tài)〔6，7〕。因此，降低CD4+CD25+T細胞的表達，有利于刺激機體產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。本研究說明DC-CIK治療后能顯著降低患者外周血CD4+CD25+Tr細胞水平，同時聯(lián)合細胞因子治療可提升療效;其機制主要為DC-CIK治療接觸了機體的免疫抑制狀態(tài)，提升了抗腫瘤免疫水平。

DC-CIK療法聯(lián)合細胞因子在乳腺癌的臨床應(yīng)用中仍存在很多問題。首先是對DC細胞、CIK細胞的抗腫瘤作用機制尚未完全明確，尚需進行大規(guī)模的基礎(chǔ)研究及其臨床研究探討具體作用機制。其次，DC細胞聯(lián)合CIK細胞免疫治療應(yīng)用在乳腺癌患者中的遠期療效及不良反應(yīng)仍缺乏大樣本的臨床研究。但是，DC細胞聯(lián)合CIK細胞，聯(lián)合細胞因子的免疫治療，具有增殖能力強，殺傷活性高的生物學特性，使其有望成為老年乳腺癌患者生物治療的首選方案之一。

4　參考文獻

1鮑鋒，盛春華，楊光，等.DC-CIK細胞治療中晚期惡性腫瘤531例分析〔J〕．中國免疫學雜志，2011; 27(4) : 360-2.

2 Yasuda T，Kamigaki T，Nakamura T，et al.Dendritic cell-tumor cell hybirds enhance the induction of cytotoxic T lymphocytes against murine colon cancer: a comparative analysis of antigen loading methods for the vaccination of immunotherapeutic dendritic cells〔J〕．Oncol Rep，2006; 16 (6) : 1317-24.

3何志惠，桑圣剛，洪濤，等.DC-CIK細胞治療對晚期惡性腫瘤患者免疫功能及生活質(zhì)量的影響〔J〕．腫瘤預(yù)防與治療，2013; 26(4) : 213-5.

4 Sivers E，Albers P，Shemidt-Wolf IG，et al.Telomerase pulsed dendritic cells for immunotherapy for renal cell carcinoma〔J〕．J Urol，2013; 171 (1) : 114-9.

5 Wing K，Ekmark A，Karlsson H，et al.Characterization of human CD25+ CD4+T cells in thymus，cord and adult blood〔J〕．Immunology，2010; 106 (2) : 190-9.

6 Wolf AM，Wolf D，Steurer M，et al.Increase of regulatory T cells in the peripheral blood of cancer patients〔J〕．Clin Cancer Res，2010; 9(2) : 606-12.

7Emens LA，Reilly RT，Jaffee EM.Breast cancer vaccines: maximizing cancer treatment by tapping into host immunity〔J〕．Endcr Relat Cancer，2005; 12(1) : 1-17.

〔2015-01-15修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

基金項目:河北省滄州市科技計劃項目(No．131302214)

〔中圖分類號〕R73

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4450-02;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.013