肉桂醛對癲癇大鼠皮質小窩蛋白表達的影響

金玉玲　王國輝　王麗華(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江　佳木斯　154007)

肉桂醛對癲癇大鼠皮質小窩蛋白表達的影響

金玉玲王國輝王麗華
(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江佳木斯154007)

〔摘要〕目的觀察小窩蛋白(Cav) -1、Survivin和EphrinA2在紅藻氨酸(KA)誘導的急性癲癇大鼠皮質表達的變化，初步探討癲癇發作機制及肉桂醛干預作用。方法將60只成年雄性Wistar大鼠隨機分成正常組、NaCl對照組、癲癇組、肉桂醛小劑量組(25 mg/ml)、肉桂醛中劑量組(37.5 mg/ml)及肉桂醛大劑量組(50 mg/ml)。KA制備癲癇模型，Western印跡檢測大鼠皮質Cav-1、Survivin和EphrinA2的表達。結果NaCl對照組和正常組Cav-1、Survivin和EphrinA2蛋白的表達無差異(P＞0.05)，癲癇組大鼠皮質Cav-1、Survivin和EphrinA2蛋白的表達顯著高于NaCl對照組(P＜0.01) ;與癲癇組比較，肉桂醛組Cav-1、Survivin和EphrinA2的表達降低，且與肉桂醛的濃度呈負相關關系(P＜0.05)。結論肉桂醛降低癲癇的發作與調節Cav-1、Survivin、EphrinA2蛋白的表達有關。

〔關鍵詞〕癲癇; Cav-1; Survivin; EphrinA2;紅藻氨酸;肉桂醛

第一作者:金玉玲(1969-)，女，副主任醫師，碩士生導師，主要從事腦損傷機制和防治的研究。

癲癇腦損傷不僅是癲癇發作的結果，也是癲癇頻發和難治的原因。由于抗癲癇藥不能迅速充分抑制癲癇發作，腦保護劑與抗癲癇藥聯合應用治療癲癇具有重要意義〔1〕。傳統中藥具有資源豐富、多靶點作用和不良反應較少等優點。肉桂醛是中藥肉桂揮發油的主要成分，具有抗菌、抗病毒和抗腫瘤等多種藥理作用〔2〕。本實驗以紅藻氨酸(KA)致癇大鼠為研究對象，觀察肉桂醛對大鼠皮質小窩蛋白(Cav) -1、Survivin和EphrinA2蛋白的影響。

1　材料和方法

1.1試劑胎牛血清(BSA)、KA購于美國sigma公司;兔源Cav-1多克隆抗體購于北京博奧森生物技術有限公司，兔源Survivin多克隆抗體和兔源EphrinA2多克隆抗體購于武漢博士德生物技術有限公司;碘化丙啶(PI)和異硫氰酸熒光素(FITC)羊抗兔IgG抗體，購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1動物選擇及分組60只成年雄性Wistar大鼠〔體重(225±25) g〕，由哈爾濱醫科大學動物實驗中心提供(許可證號:醫動字第09-2號)，分籠喂養。動物自由攝食和飲水，保持室內環境溫度〔(26±1)℃〕、濕度適宜(65.5％)，通風良好。循環日照和黑暗各12 h(日照7: 00～19: 00)。實驗前在此環境適應＞1 w。隨機將其分為六組(每組10只) :正常組、NaCl對照組、癲癇組、肉桂醛小劑量(25 mg/ml)組、肉桂醛中劑量(37.5 mg/ml)組及肉桂醛高劑量(50 mg/ml)組。

1.2.2動物模型制備Wistar大鼠用10％水合氯醛0.3～0.4 ml/kg體重腹腔注射麻醉，將大鼠固定在腦立體定位儀上，常規備皮后碘伏消毒，切開頭皮，剝離皮下組織，找到前囟，以H2O2消毒顱骨，按Paxinos＆Watson大鼠腦立體定向圖譜，以前囟為靶點(顱骨表面標記點)定位: X = 2.5 mm (右)，Y = 3.0 mm，Z=3.5 mm;根據前囟標記點和Paxinos＆Watson腦功能定位圖譜鉆孔，以鼠的顱骨解剖圖為參照，穿刺海馬CA3區，在實驗動物清醒和無菌的條件下，用1 μl微量注射器注入濃度為1.5 μg/μl的KA 1 μl(每次注射前以NaCl新鮮配制)，注射藥物時間每次持續10～15 min，0.1 μl/1 min，留針5 min。根據KA誘發鼠的伽馬波反應(EEGr)生理學及行為學改變判定癲癇鼠模型的建立。NaCl對照組相同部位等時注入等量的NaCl。

1.2.3大鼠行為學觀察大鼠海馬局部注射KA或NaCl后，以Racine等〔3〕為觀察行為變化的分級標準。癲癇大鼠發作的行為學變化的分級標準: 0級:正常行為狀態;Ⅰ級:咀嚼、眨眼、立須等面部肌肉抽搐，濕狗樣顫動;Ⅱ級:以點頭運動為主要表現的頸部肌肉抽搐;Ⅲ級:前肢陣攣、抽搐;Ⅳ級:雙側前肢伸直，伴有身體立起;Ⅴ級:跌倒和全身驚厥。Ⅲ級以下為復雜部分發作，Ⅳ級和Ⅴ級為全身強直陣攣發作。注藥后即進行行為學觀察，海馬局部注射KA的大鼠組，如果在1 h內出現Ⅰ～Ⅴ級行為變化者歸為癲癇模型。

1.2.4Western印跡蛋白檢測大腦皮質樣品蛋白裂解液與5倍上樣緩沖液混合，100℃變性5 min，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE) 100 V電泳分離后，轉移到聚偏氟丙烯(PVDF)膜，封閉過夜，一抗4℃，過夜，辣根過氧化物酶標記二抗37℃，1 h，Tris鹽酸緩沖液(TBST)漂洗。增加比學發光法(ECL)顯色試劑顯色，對照Marker記錄實驗結果，進行拍照，用凝膠圖像處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值。

1.3統計學方法應用SPSS11.5軟件進行雙尾t檢驗比較各組間的統計學差異。

2　結果

2.1癲癇大鼠皮質Cav-1、Survivin和EphrinA2蛋白的表達NaCl對照組和正常組Cav-1、Survivin和EphrinA2蛋白的表達無差異(P＞0.05) ;癲癇組大鼠皮質Cav-1蛋白、Survivin和EphrinA2蛋白表達顯著高于NaCl對照組(P＜0.01) ;肉桂醛小、中、大劑量Cav-1蛋白、Survivin和EphA2蛋白的表達與癲癇組比較明顯降低(P＜0.05)。見圖1，表1。

圖1　大鼠海馬組織Cav-1、Survivin和EphrinA2蛋白的表達

表1　大鼠皮質Cav-1、Survivin和EphrinA2蛋白表達(±s)

表1　大鼠皮質Cav-1、Survivin和EphrinA2蛋白表達(±s)

與NaCl對照組比較: 1) P＜0.01，2) P＜0.05;與癲癇組比較: 3) P＜0.01，4) P＜0.05

組別　Cav-1　Survivin　EphrinA2正常組　0.46±0.04　 0.27±0.02　 0.38±0.02 NaCl對照組　0.41±0.03　 0.25±0.02　 0.36±0.03癲癇組　0.76±0.071)　0.43±0.041)　0.76±0.041)肉桂醛小劑量組　0.55±0.062) 4)　0.35±0.032) 4)　0.68±0.021) 4)肉桂醛中劑量組　0.53±0.062) 4)　0.30±0.044)　0.65±0.031) 4)肉桂醛大劑量組　0.49±0.053)　0.29±0.034)　0.52±0.041) 3)

3　討論

癲癇的病因是多方面的，癲癇發作時大腦神經元的異常放電與神經遞質、離子通道、神經膠質細胞、突觸聯系、遺傳及免疫等的異常有密切關系，而突觸聯系與重建尤為重要。小窩是細胞質膜上的特殊凹陷結構，Cav-1與其共定位信號蛋白Survivin、EphrinA2對中樞神經系統可塑性及學習記憶及對神經干細胞的增殖和凋亡有非常重要的作用〔4，5〕。

Cav-1是小窩表面的主要組分和標志蛋白，參與大量細胞的生命活動，不但在膽固醇的轉運與胞內平衡和細胞增殖與分化等方面起重要作用〔6〕，也在神經元發育、細胞運動過程中發揮重要作用，參與膜重塑和突觸可塑性的過程〔7〕。EphrinA2屬于已知最大的酪氨酸蛋白激酶受體(RTK) Eph家族中的一員，參與多種機體調節作用，包括神經系統的細胞間相互作用，并與軸突發育的路徑有關，可能激活突觸雙向信號通路，通過破壞突觸的穩定性而激發突觸的可塑性，在神經突觸的形成和可塑性方面充當了重要的角色〔8〕。

Survivin是另一個與Cav-1在中樞神經系統(CNS)中存在的共定位信號蛋白，作為凋亡蛋白家族(IAP)的新成員，是目前發現最強的凋亡抑制因子，具有雙重角色，包括調節細胞增殖和抑制細胞凋亡〔9〕。在胚胎發育過程中，在許多組織中均有表達，神經系統尤為突出〔10〕。有研究發現，在發育早期敲除Survivin基因后可導致中樞神經系統大量凋亡細胞產生，并可導致大腦形態結構改變甚至死亡〔11〕。

Cav-1與其共定位信號蛋白EphrinA2和Survivin關系密切〔12〕。研究表明尤文氏肉瘤時，缺乏Cav-1導致微血管密度顯著降低，而這種結果與EphrinA2受體的失活有關，提示Cav-1-EphrinA2軸促進血管瘤內皮細胞遷移〔13〕。也有研究表明Cav-1作為一種腫瘤抑制基因，通過抑制Survivin的作用，抑制細胞增殖和促進細胞凋亡，在高氧肺損傷中，高氧通過抑制Survivin表達誘導細胞凋亡，Cav-1的缺失取消這個抑制，防止高氧誘導的細胞凋亡〔14〕。

癲癇確切的發病機制至今尚未完全闡明，且缺少理想的根治手段。肉桂醛是肉桂的主要成分，從肉桂油和桂皮油中分離而得，肉桂作為一種中藥，其藥用價值較為廣泛，具有促進血液循環、抗凝血酶、鎮靜、鎮痛、解熱、抗驚厥等作用〔15，16〕。

相關研究發現EphrinA2在顳葉中致癇灶周圍的表達水平明顯高于正常對照組，與本實驗結果一致〔17〕。提示肉桂醛可通過降低Cav-1的表達，一方面導致EphrinA2受體的失活，抑制EphrinA2的表達，穩定突觸，抑制突觸可塑性的激發;另一方面，抑制凋亡抑制因子Survivin蛋白的表達，減輕腦細胞凋亡，從而達到抑制癲癇的發作。

綜上所述，肉桂醛通過降低Cav-1，降低共定位蛋白Survivin和EphrinA2表達，發揮其鎮靜和抗驚厥作用，從而降低KA癲癇大鼠癇性發作，為初步了解肉桂醛抗癲癇的作用提供一定理論基礎。

4　參考文獻

1 Privitera M.Current challenges in the management of epilepsy〔J〕．Am J Manag Care，2011; 17(S7) : 195-203.

2代立娟，韓有文，李紹民，等.肉桂醛對RSV宿主細胞Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達的影響〔J〕．中國老年學雜志，2014; 34(1) : 1575-7.

3 Racine RJ，Steingart M，McIntyre DC.Development of kindling-prone and kindling-resistant rats: selective breeding and electrophysiological studies 〔J〕．Epilepsy Res，1999; 35(3) : 183-95.

4Jasmin JF，Yang M，Iacovitti L，et al.Genetic ablation of caveolin-1 increases neural stem cell proliferation in the subventricular zone(SVZ) of the adult mouse brain〔J〕．Cell Cycle，2009; 8(23) : 3978-83.

5 Santibanez JF，Blanco FJ，Garrido-Martin EM，et al.Caveolin-1 interacts and cooperates with the transforming growth factor-beta type I receptor ALK1 in endothelial caveolae〔J〕．Cardiovasc Res，2008; 77(4) : 791-9.

6Sowa G.Caveolae，caveolins，cavins，and endothelial cell function: new insights〔J〕．Front Physiol，2012; 2(2) : 120.

7Gaudreault SB，Blain JF，Gratton JP，et al.A role for caveolin-1 in postinjury reactive neuronal plasticity〔J〕．J Neurochem，2005; 92(4) : 831-9.

8Daniel TO，Stein E，Cerretti DP，et al.ELK and LERK-2 in developing kidney and microvascular endothelial assembly〔J〕．Kidney Int Suppl，1996; 57(1) : S73-81.

9Habibi E，Yokoyama S，Abdelhamed S，et al.Survivin suppression through STAT3/β-catenin is essential for resveratrol-induced melanoma apoptosis〔J〕．Int J Oncol，2014; 45(2) : 895-901.

10 Adida C，Crotty PL，McGrath J，et al.Developmentally regulated expression of the novel cancer anti-apoptosis gene survivin in human and mouse differentiation〔J〕．Am J Pathol，1998; 152(1) : 43-9.

11 Jiang Y，De Bruin A，Calda SH，et al.Essential role for surviving in early brain development〔J〕．J Neurosci，2005; 25(30) : 6962-70.

12 Vihanto MM，Vindis C，Djonov V，et al.Caveolin-1 is required for signaling and membrane targeting of EphB1 receptor tyrosine kinase〔J〕．J Cell Sci，2006; 119(11) : 2299-309.

13 Sáinz-Jaspeado M，Huertas-Martinez J，Lagares-Tena L，et al.EphA2-in-duced angiogenesis in ewing sarcoma cells works through bFGF production and is dependent on caveolin-1〔J〕．PLoS One，2013; 8 (8) : e71449.

14 Torres VA，Tapia JC，Rodríguez DA，et al.Caveolin-1 controls cell proliferation and cell death by suppressing expression of the inhibitor of apoptosis protein survivin〔J〕．J Cell Sci，2006; 119(9) : 1812-23.

15張鵬霞，楊玉，孫寧寧，等.白術、附子、肉桂合劑對老年小鼠腦線粒體Ca2+和腦細胞凋亡的影響〔J〕．中國老年學雜志，2010; 30 (20) : 2963-4.

16黃宏妙，郭占京，羅佩卓，等.肉桂水提液對全腦缺血再灌注損傷大鼠羥自由基和谷胱甘肽過氧化物酶的影響〔J〕．中國老年學雜志，2010; 31(16) : 3083-5.

17尹俊鋒，張璐，連亞軍，等.軸突導向因子EphrinA2在難治性癲癇患者顳葉中的表達〔J〕．中國實用神經疾病雜志，2012; 15(3) : 21-3.

〔2015-01-14修回〕

(編輯袁左鳴)

基金項目:黑龍江省教育廳項目(12521572)

〔中圖分類號〕R742.1

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4452-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.014