巴戟天多糖對去卵巢大鼠核因子-κB受體激活因子配體和骨保護素表達的影響

劉亦恒　張　壽　朱振標　沈　慧　吳多慶　丁曉莉(海口市人民醫院骨科中心，海南　海口　570208)

巴戟天多糖對去卵巢大鼠核因子-κB受體激活因子配體和骨保護素表達的影響

劉亦恒張壽朱振標沈慧吳多慶丁曉莉
(海口市人民醫院骨科中心，海南海口570208)

〔摘要〕目的觀察巴戟天多糖對去卵巢大鼠骨組織核因子-κB受體激活因子配體(RANKL)和骨保護素(OPG) mRNA表達的影響。方法

成年雌性SD大鼠30只，隨機分為假手術組、模型組、巴戟天多糖組，采用摘取雙側卵巢法建立骨質疏松模型，造模2 w后開始給藥，給藥3個月后觀察各組大鼠骨密度(BMD)，骨鈣、骨磷含量，RANKL、OPG mRNA的表達水平。結果給藥3個月后巴戟天多糖組能顯著提高去卵巢大鼠的BMD和骨鈣、磷的含量，上調OPG mRNA表達，下調RANKL mRNA表達，使RANKL/OPG值下降。結論巴戟天多糖對去卵巢所致的大鼠骨質疏松具有良好的防治作用，其機制可能與調控RANKL和OPG mRNA的表達，降低RANKL/OPG值有關。

〔關鍵詞〕絕經后骨質疏松;巴戟天多糖;核因子-κB受體激活因子配體;骨保護素

第一作者:劉亦恒(1976-)，男，博士，副主任醫師，主要從事骨質疏松、脊柱脊髓損傷研究。

絕經后骨質疏松(PMOP)是指絕經后婦女由于體內卵巢功能降低、雌激素水平下降、骨耦聯過程失調、破骨細胞的骨吸收作用大于成骨細胞的骨形成所導致的骨量減少，骨脆性增加，進而易于發生骨折的代謝性骨疾病。前期實驗表明，巴戟天多糖能促進成骨細胞的增殖能力和堿性磷酸酶(ALP)的活性，影響骨代謝〔1〕。本實驗觀察巴戟天多糖對雌性去卵巢大鼠骨密度(BMD)，骨鈣、骨磷含量，核因子-κB受體激活因子配體(RANKL)和骨保護素(OPG) mRNA表達的影響。

1　材料與方法

1.1材料與儀器健康雌性SD大鼠30只，3月齡，體重(270±10) g，購自海南醫學院;巴戟天藥材產于海南萬寧; TRIzol Reagent，美國Invitrogen公司; RT及Real Time PCR試劑盒，大連生物工程有限公司; DPX-L型雙能X射線骨密度儀(美國Lunar公司) ;實時熒光定量PCR儀7500型(美國ABI公司) ;酶標儀(北京六一儀器)等。

1.2方法

1.2.1巴戟天多糖的制備取200 g巴戟天干制品粉碎，烘干，過40目篩，加入10倍體積的水，煮沸1 h，濾過，再加入3倍體積的乙醇，靜置12 h，收集沉淀，得巴戟天燥粗多糖;粗多糖加水復溶，用Sevag法脫蛋白(重復2次)，活性炭脫色，無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，濾過。用蒸餾水溶解沉淀物，用無水乙醇加至其濃度為85％，離心收集沉淀物，得巴戟天多糖純品。由海南醫學院藥學系制備鑒定。

1.2.2去卵巢大鼠模型制備隨機取20只大鼠，用2％戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔麻醉，取背側雙切口。于脊柱外側2 cm，髂前上棘上方1.5 cm，備皮去毛，消毒后切開局部皮膚、肌肉和腹膜，輕輕將脂肪團拉開并分離，暴露卵巢，結扎卵巢下端輸卵管，摘除卵巢，縫合切口。另10只大鼠只做手術切口，不去除卵巢。

1.2.3實驗分組30只雌性SD大鼠分為模型組(生理鹽水+去卵巢)，假手術組(生理鹽水+假手術)，巴戟天多糖組(去卵巢+100 mg/kg巴戟天多糖)。術后2 w開始，巴戟天多糖組予灌胃給藥，假手術組和模型組給予等體積的生理鹽水，共12 w。

1.2.4BMD及骨鈣、骨磷測定于術后3個月，在麻醉狀態下對各組大鼠用雙能X射線骨密度儀的小動物測量軟件測定右股骨頸的骨密度(BMD)。BMD測定后收集大鼠右側股骨，馬福爐800℃灰化，灰化后標本測定骨中鈣、磷的百分含量。

1.2.5實時定量PCR檢測應用Real time-PCR儀檢測實驗大鼠第三腰椎骨組織中RANKL和OPG mRNA表達。

1.2.5.1骨組織總RNA的提取術后3個月，取大鼠第三腰椎，剔除周圍軟組織，0.9％鹽水沖洗，吸干水分，放入液氮中30 min，再取出置室溫下5 min，重復凍融三次。加液氮在研缽中，研碎骨組織，按TRIzol試劑說明書提取總RNA，用DEPC處理水溶解。分光光度計260/280測定RNA樣品濃度并進行質量鑒定，瓊脂糖凝膠電泳證實總RNA的完整性。

1.2.5.2 cDNA第一鏈的合成取2 μg總RNA，按RT-PCR試劑盒操作手冊進行操作，合成cDNA，置－70℃保存。

1.2.5.3實時定量PCR檢測根據目的基因在Genbank中的已知序列，由生工生物工程有限公司設計、合成。引物序列如下，GAPDH:上游5'-TGA ACG GGA AGC TCA CTG G-3'，下游5'-TCC ACC ACC CTG TTGCTG TA-3'; OPG:上游5'-CAT CGA AAG CAC CCT GTA-3'，下游5'-CAC TCA GCC AAT TCG GTA T-3'; RANKL:上游5'-CGT ACC TGC GGA CTATCT TCA-3'，下游5'-GTT GGA CAC CTG GACGCT AA-3'。按熒光定量PCR儀操作手冊添加樣本，三步法進行PCR反應。擴增條件: 95℃預變性5 min ;然后95℃變性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸35 s，共循環40次。

1.3統計學方法采用SPSS15.0軟件進行t檢驗。

2　結果

2.1巴戟天多糖對去卵巢大鼠BMD及骨鈣、磷的影響與假手術組比較，模型組BMD和骨鈣、磷含量均降低(P＜0.05) ;與模型組比較，巴戟天多糖組BMD和骨鈣、磷含量均升高(P＜0.05)。見表1。

2.2巴戟天多糖對去卵巢大鼠RANKL和OPG mRNA表達的影響與假手術組比較，模型組大鼠RANKL mRNA表達水平增高，OPG mRNA表達水平降低，RANKL/OPG值增高(P＜0.01) ;與模型組比較，巴戟天多糖組RANKL mRNA表達降低，OPG mRNA表達增高，RANKL/OPG值降低(P＜0.05)。見表2。

表1　巴戟天多糖對去卵巢大鼠BMD及骨鈣、磷的影響(±s，n=10)

表1　巴戟天多糖對去卵巢大鼠BMD及骨鈣、磷的影響(±s，n=10)

與假手術組比較: 1) P＜0.01，2) P＜0.05;與模型組比較: 3) P＜0.05，4) P＜0.01

組別　BMD(g/cm2)　　骨鈣(％)　　骨磷(％)模型組　0.158±0.0151)　61.47±2.862)　27.64±1.212)假手術組　0.227±0.024　 64.98±1.35　 29.74±1.47巴戟天多糖組　0.219±0.0124)　64.19±1.263)　29.37±1.853)

表2　巴戟天多糖對去卵巢大鼠RANKL、OPG mRNA表達及RANKL/OPG比值的影響(±s，n=10)

表2　巴戟天多糖對去卵巢大鼠RANKL、OPG mRNA表達及RANKL/OPG比值的影響(±s，n=10)

與假手術組比較: 1) P＜0.01;與模型組比較: 2) P＜0.05，3) P＜0.01

組別　RANKL　OPG　RANKL/OPG模型組　6.832±2.1441)　0.214±0.0511)　33.282±10.2921)假手術組　1.147±0.372　 1.258±0.254　 0.926±0.215巴戟天多糖組　4.413±1.2522)　0.765±0.1723)　5.215±1.4873)

3　討論

絕經后婦女因雌激素水平急劇下降，從而導致骨代謝平衡破壞，骨量在數年內迅速丟失。據調查，PMOP患病率達18％～25％，主要表現為腰背部疼痛，身高逐漸縮短，甚至輕微的外力作用就可能發生骨折〔2，3〕。因此，如何預防PMOP一直是相關領域的研究熱點。巴戟天是我國四大南藥之一，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功效。現代研究證明，巴戟天含有多種化學成分，如蒽醌類、多糖類、氨基酸、烯醚萜及其苷類等，多糖類在巴戟天含量占20％左右〔4，5〕。近年來，有研究表明巴戟天能增加去卵巢小鼠子宮重量及血清雌二醇含量，具有雌激素樣作用〔6〕。進一步的研究發現巴戟天多糖可以刺激體外培養的骨髓基質細胞及成骨細胞(0B)增殖〔7〕，這預示著巴戟天用于防治骨質疏松(OP)具有重要的研究意義。

BMD值是反映OP程度，預測骨折危險性的重要依據，也是診斷OP的重要指標。OP總是伴隨骨總量的丟失，即是鈣、磷的喪失，因此應用骨鈣、骨磷含量的變化評價OP藥物治療的有效性已得到了廣泛的認同。本文結果說明巴戟天多糖有促進大鼠骨礦物含量增加，提高BMD的作用。

目前對骨代謝研究發現，存在于破骨細胞前體細胞膜表面的核因子-κB受體激活因子(RANK)是前體細胞被激活和分化成破骨細胞最重要的信號通道，而成骨細胞分泌的RANKL激活該通道。同時，成骨細胞也分泌RANKL的可溶性餌受體OPG，從而與RANKL競爭性結合并阻斷其與RANK的結合，起到抑制破骨細胞生成和活化作用〔8，9〕。本實驗表明，巴戟天多糖能通過夠降低RANKL mRNA的表達，提高OPG mRNA的表達，達到抑制破骨細胞的激活和分化作用。綜上，巴戟天多糖可以增加去卵巢大鼠骨礦物質含量，提高BMD;通過調節RANKL和OPG mRNA的表達，降低RANKL/OPG值，達到抑制破骨細胞的目的，起到防治去卵巢大鼠所致OP的作用。

4　參考文獻

1崔可賾，劉亦恒，張壽，等.巴戟天多糖含藥血清對體外成骨細胞DKK-1表達的影響〔J〕．時珍國醫國藥，2012; 23(4) : 871-2.

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3de Oliveira Ferreira N，da Silva RB，Arthuso M，et al.Prevalence of vertebral fractures and quality of life in a sample of postmenopausal Brazilian women with osteoporosis〔J〕．Arch Osteoporosis，2012; 7(1) : 101-6.

4梁麗敏，徐勇.南藥巴戟天多糖的研究進展〔J〕．食品工業科技，2011; 32(8) : 478-80.

5張海龍，張慶文，張曉琦，等．南藥巴戟天的代學成分〔J〕．中國天然藥物，2010; 8(3) : 192-5．

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7李楠，王和鳴，郭素華，等.巴戟天多糖及其水提物對體外培養成骨細胞活性的影響〔J〕．中國組織工程研究與臨床康復，2007; 11 (23) : 4570-2.

8 Anastasilakis AD，Toulis KA，Polyzos SA，et al.RANKL inhibition for the management of patients with benign metabolic bone disorders〔J〕．Exp Opin Invest Drugs，2009; 18(8) : 1085-102.

9 Wittrant Y，Theoleyre S，Couillaud S，et al.Relevance of an in vitro osteoclastogenesis system to study receptor activator of NF-κB ligand and osteoprotegerin biological activities〔J〕．Exp Cell Res，2004;293(2) :292-304．

〔2014-08-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

基金項目:海南省自然科學基金(No.811156) ;海南省衛生廳資助項目(No.瓊衛2010-69) ;海口市重點科技項目(No.2011-0135)

〔中圖分類號〕R274.9

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4456-02;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.016