不同溫度對人類肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶蛋白及突變體交聯(lián)反應(yīng)的影響

徐　燕　邵世濱　董　立　閆曉華　高　音(山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生物化學(xué)教研室，山東　臨沂　7600)

不同溫度對人類肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶蛋白及突變體交聯(lián)反應(yīng)的影響

徐燕邵世濱董立1閆曉華1高音2
(山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生物化學(xué)教研室，山東臨沂276002)

〔摘要〕目的研究不同溫度對人類肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(hPPI)體外交聯(lián)反應(yīng)的影響。方法以人總RNA為模板設(shè)計正反引物進行hPPI基因克隆，以獲取的正常型表達載體為模板，利用PCR定點突變的方法將hPPI基因中兩個半胱氨酸(Cys)突變?yōu)榻z氨酸(Ser)，經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達正常型和突變型蛋白，在不同溫度條件下進行蛋白交聯(lián)反應(yīng)，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)鑒定交聯(lián)現(xiàn)象。結(jié)論與溶菌酶表現(xiàn)相似，正常型hPPI蛋白交聯(lián)反應(yīng)隨溫度升高而逐漸加快，在達到蛋白變性溫度時交聯(lián)反應(yīng)最明顯，出現(xiàn)大量二聚體和多聚體條帶;將突變型hPPI蛋白置于與正常型hPPI蛋白完全相同的反應(yīng)條件下，觀察不到任何交聯(lián)條帶。結(jié)論熱變性可顯著改變蛋白高級結(jié)構(gòu)，蛋白對熱變性無明顯特異性，在變性溫度臨界條件下表現(xiàn)出相同的聚合作用;二硫鍵可導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)改變，從而影響交聯(lián)結(jié)果。

〔關(guān)鍵詞〕人類肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(hPPI) ;蛋白質(zhì)交聯(lián);定點突變;溫度;二硫鍵

1山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校檢驗系2首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

第一作者:徐燕(1979-)，女，碩士，講師，主要從事蛋白質(zhì)工程研究。

蛋白質(zhì)在機體內(nèi)通過折疊形成復(fù)雜的結(jié)構(gòu)以單聚體或多聚體的形式存在進而發(fā)揮生物學(xué)功能。如果蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化進而聚合產(chǎn)生沉積將導(dǎo)致疾病的發(fā)生，稱為構(gòu)象病。帕金森病就是由于GAPDH蛋白的大量聚合導(dǎo)致病癥惡化〔1～3〕。利用體外的交聯(lián)實驗對于研究體內(nèi)蛋白的折疊及高級結(jié)構(gòu)的形成以及蛋白結(jié)構(gòu)對功能制約作用有重要意義。人類肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(hPPI)是生物體內(nèi)重要的催化折疊反應(yīng)的酶，廣泛存在于各種組織和器官，能夠加速自身折疊和體內(nèi)新生肽鏈折疊及變性蛋白質(zhì)的體外折疊，其催化反應(yīng)主要通過改變蛋白上脯氨酸殘基的構(gòu)象而發(fā)揮作用〔4〕。hPPI蛋白參與多種疾病的發(fā)生過程，包括病毒感染的發(fā)病機制、心血管疾病和癌癥等。例如，hPPI蛋白被證實在多個癌癥類型的細胞或組織中異常高表達，并且其活性與患者康復(fù)狀況顯著相關(guān)〔5〕。hPPI蛋白可以與CD147膜受體相互作用促進癌細胞增殖，抗凋亡，細胞遷移和入侵等過程〔6，7〕。因此，hPPI蛋白可作為腫瘤治療的靶分子。本實驗觀察不同溫度對hPPI蛋白活性及突變體交聯(lián)反應(yīng)的影響。

1　材料與方法

1.1實驗材料異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)原核表達質(zhì)粒pTrcHisC購于美國Invitrogen公司，克隆用的工程菌株E.coli DH5購自大連寶生物有限公司(Takara)，各種限制性內(nèi)切酶購自賽默飛生物公司，IPTG購自北京鼎國生物科技有限公司，蛋白純化柱購于美國默克生物。Bradford法蛋白定量試劑盒購自大連寶生物有限公司，PAGE-SDS相關(guān)試劑購自北京鼎國生物科技有限公司。293T細胞來自實驗室保存細胞株，用于hPPI基因的克隆實驗。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司，實驗用PCR引物和溶菌酶由上海生物工程有限公司提供。

1.2RNA提取293T細胞系于液氮復(fù)蘇后于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5％ CO2，含10％胎牛血清的改良杜氏伊格爾(DMEM)完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后收集細胞用于提取。總RNA的制備利用Trizol法，取105～106細胞于1.5 ml離心管中，利用1 ml的trizol進行細胞裂解。待裂解充分后加取200 μl的三氯甲烷混勻進行有機萃取，室溫放置5 min后進行18 000 r/min離心15 min，吸取上清液400 μl到新的1.5 ml離心管中，加取500 μl的異丙醇進行RNA純化，18 000 r/min離心10 min后棄去上清液，加700 μl的75％的無水乙醇進行二次純化，棄去上清液后放置數(shù)分鐘待乙醇完全揮發(fā)后加DEPC處理水進行RNA溶解，放于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3hPPI基因克隆利用提取的RNA為模板，經(jīng)RT-PCR反應(yīng)生成cDNA模板用于hPPI基因的克隆。RT-PCR利用Takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行操作。利用cDNA為模板，根據(jù)基因組數(shù)據(jù)庫(Genbank)中的hPPI基因注釋(NM_021130.3)設(shè)計引物進行基因克隆。引物序列末端分別添加PstⅠ和EcoRⅠ內(nèi)切酶用于表達質(zhì)粒載體構(gòu)建，序列信息如下: PPI-正義(Pst Ⅰ) CTGCAGATGGTCAACCCCACCGTGTTCT和PPI-反義(EcoR Ⅰ) GAATTCTGACTGTGGACAACTCGAATAA (由上海生物工程有限公司合成引物)。反應(yīng)程序如下: 94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，延伸40 s，重復(fù)30個循環(huán)后延伸3 min，1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序鑒定。

1.4原核表達系統(tǒng)的構(gòu)建克隆獲得的hPPI基因經(jīng)測序正確無誤后，利用雙酶切和連接反應(yīng)構(gòu)建pTrcHisC-hPPI原核表達系統(tǒng)。分別取hPPI克隆產(chǎn)物10 μl和pTrcHisC質(zhì)粒5 μl進行PstⅠ和EcoRⅠ雙酶切37℃反應(yīng)3 h，然后利用T4連接酶試劑盒按照操作說明進行連接反應(yīng)3 h，最后取5 μl連接產(chǎn)物加入到100 μl的DH5A感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化，37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 h后挑取單克隆進行PvuI和XhoI雙酶切鑒定，挑取陽性菌株送往上海美吉生物科技有限公司進行鳥槍法測序確認。見圖1。

圖1　pTrcHisC載體結(jié)構(gòu)圖示

1.5突變型表達系統(tǒng)的構(gòu)建二硫鍵對蛋白質(zhì)的折疊及穩(wěn)定性發(fā)揮重要作用，二硫鍵的破壞可能直接造成蛋白結(jié)構(gòu)甚至功能的改變。hPPI蛋白中含有兩個(第52和第62位)半胱氨酸(Cys)，利用定點突變的方法將其突變?yōu)榻z氨酸(Ser)。以正常型的表達載體為模板設(shè)計定點突變引物，正向引物mu為GTTCCTCCTTTCACAGAATTATTCCAGGGTTTATGTCCCAGGGTG和反向引物mu為CACCCTGGGACATAAACCCTGGAATAATTCTGTGAAAGGAGGAAC。利用大連寶生物的primer STAR高保真taq酶進行PCR擴增，運行程序如下: 98℃15 s，68℃5 min，30個循環(huán)后延伸10 min。切膠回收PCR產(chǎn)物后利用Dpn1酶進行消化處理3 h，去除模板DNA。取消化后的產(chǎn)物10 μl進行轉(zhuǎn)化實驗，挑取克隆送往上海生物工程公司進行測序鑒定突變表達載體。

1.6純化和柱式純化將構(gòu)建好的野生型和突變型質(zhì)粒用IPTG進行誘導(dǎo)表達，表達后的產(chǎn)物經(jīng)PAGE-SDS鑒定。鑒定正確后，大量擴繁培養(yǎng)，利用終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)表達以獲取大量的蛋白。首先將菌液4℃條件下18 000 r/min離心10 min，PBS清洗后加入1/20體積的裂解液于菌體吹勻懸浮，37℃裂解0.5 h后利用超聲波破碎3次，每次15 s。最后利用Talon金屬親和層析樹脂純化柱純化目的蛋白，用25 mmol/L，pH=7.6的Tris-HCl溶液透析3次，每次1 h，純化后的蛋白用12％的SDS-PAGE電泳檢測。將純化的蛋白利用BCA法測定蛋白濃度，方法參見試劑盒說明。

1.7蛋白交聯(lián)反應(yīng)將純化的蛋白于冰凍干燥機上低溫濃縮后用于蛋白交聯(lián)實驗。溶菌酶、正常型蛋白、突變型蛋白分別在4℃、20℃和75℃水浴孵育各45 min，進行交聯(lián)反應(yīng)實驗，然后用12％的PAGE電泳進行確認。

2　結(jié)果

2.1野生型和突變型hPPI表達系統(tǒng)的鑒定利用特異性引物，成功從293T細胞中克隆出hPPI基因(圖2a)，hPPI基因的cDNA全長498 bp，連同兩邊的酶切位點PstⅠ和EcoRⅠ共510 bp。并經(jīng)測序鑒定正確后，通過雙酶切反應(yīng)連接到pTrcHisC-hPPI表達載體上。為了方便酶切后用瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性質(zhì)粒，選取表達載體上另外一對內(nèi)切酶PvuⅠ和XhoⅠ，見圖1。進行酶切，若電泳檢測產(chǎn)物約1 400 bp和3 600 bp(圖2b)。兩條帶即為陽性質(zhì)粒，挑取酶切鑒定后的質(zhì)粒進一步測序確認，成功獲取野生型的hPPI蛋白表達載體系統(tǒng)(圖2c)。然后利用野生型表達載體pTrcHisC-hPPI為模板進行定點突變，利用mu為突變引物進行PCR擴增整個質(zhì)粒，經(jīng)DpnⅠ酶消化后轉(zhuǎn)化，挑取克隆，如野生型一樣的程序進行陽性質(zhì)粒鑒定，最終獲取突變型質(zhì)粒。成功將52位和62位Cys突變?yōu)镾er，將其密碼子序列分別由TGC和TGT突變?yōu)锳GC(圖2c)。

圖2　hPPI蛋白野生型和突變型表達系統(tǒng)鑒定分析

2.2野生型和突變型hPPI蛋白的純化與鑒定野生型和突變型pTrcHisC-hPPI表達載體系統(tǒng)均可以表達含有6個組氨酸標簽(6XHis)的融合蛋白，可以利用固定化金屬螯合親和層析技術(shù)(IMAC)進行hPPI蛋白的純化和分離。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后的總蛋白中目標蛋白hPPI條帶明顯，經(jīng)IMAC純化后可以顯著地富集到純度較好的野生型和突變型hPPI蛋白，其他雜蛋白的含量大大降低，可以用于下一步的交聯(lián)實驗。見圖3。

圖3　hPPI蛋白野生型和突變型的12％ SDS-PAGE電泳鑒定

2.3野生型hPPI蛋白在不同溫度下的交聯(lián)反應(yīng)hPPI蛋白和溶菌酶蛋白大小相當，其蛋白變性溫度比較接近。4℃孵育40 min后溶菌酶蛋白出現(xiàn)少量的二聚體，基本沒有三聚體和多聚體的出現(xiàn);在20℃的條件下孵育40 min后溶菌酶開始出現(xiàn)少量的三聚體復(fù)合物，同4℃條件下未出現(xiàn)明顯的差別，蛋白基本處于單聚體形式存在，無交聯(lián)后共價鍵的形成;直到70℃的高溫條件下，開始形成大量的二聚體和多聚體復(fù)合物，說明蛋白高溫熱變性后使得蛋白分子聚合交聯(lián)反應(yīng)利于形成多聚體。同時說明這3個溫度梯度適合用于hPPI蛋白的熱交聯(lián)實驗。hPPI蛋白在4℃條件下孵育40 min后，基本以單聚體和少量的二聚體存在，無高聚體的形成;而在20℃條件下孵育40 min后，二聚體甚至多聚體蛋白明顯增多，并且在單聚體和二聚體之間存在不少過渡復(fù)合物的形式;在75℃條件下孵育40 min后，類似于溶菌酶開始形成大量的二聚體和多聚體復(fù)合物?？梢?，熱變性條件可以明顯改變蛋白的高級結(jié)構(gòu)和存在形式。見圖4。

2.4突變型hPPI蛋白在不同溫度下的交聯(lián)反應(yīng)突變型的hPPI蛋白在4℃、20℃和75℃交聯(lián)反應(yīng)的孵育溫度條件下，均未檢測到二聚體和多聚體的存在，說明hPPI蛋白二硫鍵的破壞徹底破壞蛋白質(zhì)單鏈之間的聚合作用，即便是在變性后仍舊不會形成多聚體。見圖4。

圖4　不同溫度條件下溶菌酶和野生型、突變型hPPI蛋白交聯(lián)反應(yīng)

3　討論

本實驗說明，熱變性可以顯著改變蛋白的高級結(jié)構(gòu)，蛋白對熱變性無明顯特異性，在變性溫度的臨界條件下會表現(xiàn)出相同的聚合作用;這點在其他研究中得到一致的結(jié)果，席慧〔8〕利用硫氧還蛋白、核糖核酸酶HII和溶菌酶為實驗材料進行熱變性交聯(lián)實驗，證實這三種蛋白在臨界溫度反應(yīng)時，出現(xiàn)交聯(lián)二聚化和多聚化現(xiàn)象。二硫鍵被公認是蛋白結(jié)構(gòu)中極為重要的共價鍵，二硫鍵可以導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)的改變。本實驗說明二硫鍵對維持蛋白的高級結(jié)構(gòu)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。因此，改變二硫鍵可以改變蛋白的聚合作用。而利用N-acetylcysteine還原劑破壞GAPDH分子間二硫鍵的形成阻斷交聯(lián)反應(yīng)和蛋白聚集，從而能夠減少帕金森病細胞損傷對細胞產(chǎn)生保護作用。在羊毛紡織生產(chǎn)上，利用破壞二硫鍵來純化羊毛角蛋白是最為普遍的方法〔9〕。可見，二硫鍵可以通過維持蛋白結(jié)構(gòu)和改變蛋白的聚合作用從而影響蛋白的功能。hPPI蛋白可以促進反轉(zhuǎn)錄病毒在感染過程的自身反轉(zhuǎn)錄過程。利用人類27不同的細胞系進行HIV病毒的感染實驗，證實hPPI蛋白可以顯著促進HIV病毒的反轉(zhuǎn)錄過程〔10〕。因此，本實驗研究溫度和二硫鍵對hPPI蛋白的結(jié)構(gòu)及聚合體的影響為進一步改變和有效降低蛋白活性提供思路。

4　參考文獻

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10 DeIaco A，Luban J.Cyclophilin A promotes HIV-1 reverse transcription but its effect on transduction correlates best with its effect on nuclear entry of viral cDNA〔J〕．Retrovirology，2014; 11: 11.

〔2014-07-17修回〕

(編輯苑云杰)

基金項目:山東省高等學(xué)校科技計劃項目資助(No．J13LK18)

〔中圖分類號〕Q51

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4460-04;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.018