腦膠質瘤細胞MGMT甲基化狀態與細胞對烷化劑耐藥性的關系

李培棟　王新軍　單　嶠　吳躍輝　王　振(鄭州大學第五附屬醫院神經外科，河南　鄭州　450052)

腦膠質瘤細胞MGMT甲基化狀態與細胞對烷化劑耐藥性的關系

李培棟王新軍單嶠吳躍輝王振
(鄭州大學第五附屬醫院神經外科，河南鄭州450052)

〔摘要〕目的探討腦膠質瘤細胞O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(MGMT)基因啟動子甲基化狀態與細胞對烷化劑藥物(TMZ)耐藥性的相關性。方法取處于對數生長期的人腦膠質瘤細胞系U87-MG、T98G和U251，利用MTT法檢測不同濃度TMZ對上述三種膠質瘤細胞系的作用。提取細胞基因組DNA，用甲基化特異性PCR(MS-PCR)檢測膠質瘤細胞中MGMT基因甲基化狀態。結果與對照組(0.1％DMSO)相比，TMZ僅能抑制U87-MG細胞的活性(P＜0.05)，而不能抑制T98G和U251細胞的活性(P＞0.05) ;運用MS-PCR檢測到U87-MG存在MGMT啟動子甲基化，而T98G和U251均不存在MGMT啟動子甲基化。結論U87-MG、T98G和U251人腦膠質瘤細胞系MGMT啟動子甲基化狀態與細胞對烷化劑的敏感性存在相關性。

〔關鍵詞〕膠質瘤;替莫唑胺;耐藥性; MGMT啟動子甲基化

第一作者:李培棟(1971-)，男，副主任醫師，主要從事腦血管病、腦腫瘤的外科治療研究。

腦膠質瘤的治療包括手術治療、化療和放療等，術后化療是治療腦膠質瘤重要的輔助手段。替莫唑胺(TMZ)是一類新型烷化劑，是腦膠質瘤術后化療的重要藥物，對腦膠質瘤的作用可能與O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉移酶(MGMT)啟動子甲基化相關〔1〕。然而，腦膠質瘤對TMZ的耐藥現象很常見〔2，3〕，而且膠質瘤的標本不易得到，因此應用人源性腦膠質瘤細胞系研究耐藥機制受到關注。本實驗旨在應用U87-MG、T98G和U251人腦膠質瘤細胞系研究腦膠質瘤細胞MGMT基因甲基化狀態與細胞對烷化劑耐藥性之間的關系，為提高腦膠質瘤患者化療效果提供理論依據。

1　材料與方法

1.1實驗材料人腦膠質瘤細胞株U87-MG、T98G和U251 (ATCC公司)，DMEM、胎牛血清(FBS) (GIBCO公司)，二甲基亞砜(DMSO)、替莫唑胺(Sigma公司)，四甲基偶氮唑藍(MTT，Sigma公司)，基因組DNA提取試劑盒、DNA甲基化修飾試劑盒(美國ZMYO RESEARCH公司)，DNA聚合酶(日本Takara公司)。

1.2細胞培養凍存的膠質瘤細胞系U87-MG、T98G和U251從液氮罐中取出，迅速投入37℃水浴至融化，離心后小心棄上清，取配制好的含10％FBS的DMEM培養液輕輕吹打混勻，置于37℃5％CO2的培養箱中進行培養，待細胞達70％～80％匯合時用于實驗。

1.3MTT法檢測TMZ對膠質瘤細胞系的作用將TMZ溶于DMSO中配制成終濃度為10 mM，放置于－20℃保存，用時倍比稀釋至所需濃度。取腦膠質瘤U87-MG、T98G和U251細胞，將細胞濃度為2×104/ml的懸液接種于96孔板中，每孔100 μl，放入細胞培養箱中培養24 h后棄去上清，分別加入0.4、4、40 μmol/L TMZ(0.4、4、40 μmol/L)作用48 h后加入20 μl的MTT，37℃孵育4 h后，棄上清，然后加入DMSO 150 μl，15 min后用酶標儀(Tacan，Switzerland)在570 nm處測定各孔吸光度。根據吸光度值計算細胞存活率。藥物敏感性的判斷標準為: 1× PPC濃度(4 μmol/L)的TMZ能抑制膠質瘤細胞活性為敏感，1×PPC濃度(4 μmol/L)的TMZ不能抑制膠質瘤細胞活性為耐藥。

1.4細胞DNA的提取用DNA提取試劑盒對U87-MG、T98G 和U251細胞進行DNA提取，具體操作步驟按照試劑盒的說明書進行，提取后用紫外分光光度計進行DNA濃度的檢測。

1.5MGMT基因擴增用DNA甲基化修飾試劑盒進行亞硫酸氫鹽的修飾，步驟參照所用試劑盒的說明書。甲基化和未甲基化引物的設計參照文獻〔3〕，引物序列MGMT甲基化上游: TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC，下游: GCACTCTTCCGAAAACGAAACG，81 bp; MGMT非甲基化上游: TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT，下游: AACTCCACACTCTTCCAAAAACAAAACA，93 bp。引物由日本Takara生物技術有限公司進行合成。

采用甲基化特異性PCR(MS-PCR)方法，以修飾所得的基因組DNA作為標本，選用Taq DNA聚合酶對MGMT啟動子序列進行擴增。擴增的循環參數: 95℃5 min; 95℃45 s，引物退火溫度30 s，72℃60 s，共35個循環; 72℃延伸5 min。待反應結束后，對擴增產物用2％瓊脂糖凝膠進行電泳，用溴乙啶染色，在凝膠成像系統下進行結果觀察。結果判定:出現非甲基化條帶而且沒有出現甲基化條帶則判定為MGMT啟動子非甲基化;出現甲基化條帶時則判定為MGMT啟動子甲基化狀態。1.6統計學方法應用SPSS13.0軟件行t檢驗。

2　結果

2.1TMZ對膠質瘤細胞系的活性影響與對照組(0.1％DMSO)相比，4 μmol/L的TMZ能降低U87-MG細胞存活率至89.7％(P＜0.05)，40 μmol/L的TMZ使細胞存活率降至67.3％ (P＜0.05)。對于T98G和U251細胞系，0.4、4 μmol/L和40 μmol/L的TMZ均不能抑制細胞的細胞活性(P＞0.05)。因此，在所檢測的膠質瘤細胞系中，U87-MG對TMZ敏感，而T98G和U251細胞系對TMZ不敏感。見圖1。

圖1　TMZ對三種膠質瘤細胞的作用

2.2三種膠質瘤細胞中MGMT啟動子甲基化狀態檢測U87-MG細胞出現甲基化條帶(M)，表明U87-MG細胞存在MGMT啟動子呈甲基化狀態;而T98G和U251細胞出現非甲基化條帶(U)，且沒有出現甲基化條帶(M)，表明T98G和U251細胞MGMT啟動子為非甲基化狀態。見圖2。

圖2　MGMT基因啟動子的MS-PCR擴增

3　討論

腦膠質瘤是最常見的惡性的原發性顱內腫瘤，化療是腦膠質瘤綜合治療措施中重要組成部分。TMZ是一種咪唑四嗪類衍生物，為新型烷化劑，具有口服后吸收率高，脂溶性強，易透過血腦屏障，并且不良作用小等優勢藥理特性，已成為腦膠質瘤的一線化療藥物〔4〕。研究表明膠質瘤細胞對TMZ敏感性可能與MGMT的表達水平相關。MGMT是DNA修復酶中的一種，可以對烷化劑等藥物造成的DNA損傷進行修復，進而使腫瘤細胞產生耐藥，并且其蛋白表達受MGMT基因啟動子甲基化狀態調節。MGMT基因啟動子甲基化導致MGMT蛋白表達降低，反之，MGMT基因啟動子非甲基化導致MGMT蛋白表達增高。大量文獻研究數據表明，腫瘤組織對烷化劑產生耐藥性的主要原因是MGMT蛋白在腦膠質瘤組織中的表達〔5，6〕。一項臨床隨機對照試驗〔7〕指出膠質瘤患者MGMT啟動子甲基化與TMZ的治療相關: MGMT啟動子甲基化的患者受益于TMZ的治療，而非甲基化的患者則沒有顯示出對TMZ的獲益。

本研究證實U87-MG、T98G和U251人膠質瘤細胞系對TMZ的敏感性與其MGMT啟動子甲基化狀態相關，提示膠質瘤細胞系對烷化劑TMZ的敏感性與其MGMT啟動子甲基化狀態。這一研究結果與之前的研究結果一致〔7～9〕。

綜上所述，本研究證實膠質瘤細胞MGMT啟動子甲基化與膠質瘤對烷化劑耐藥有密切關系，為臨床化療藥物的選擇提供了理論依據。

4　參考文獻

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9 Ueda S，Mineta T，Nakahara Y，et al.Induction of the DNA repair gene O6-methylguanine-DNA methyltransferase by dexamethasone in glioblastomas〔J〕．J Neurosurg，2004; 101(4) : 659-63.

〔2015-01-13修回〕

(編輯袁左鳴)

〔中圖分類號〕R73

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4463-02;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.019