基于同源模建技術(shù)的抗肝癌單鏈抗體人源化抗體庫(kù)設(shè)計(jì)

葉　剛　劉　麗　楊冬華　湯紹輝　周　旻丁世華　韋宏成　鐘　健(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東　廣州　5063)

基于同源模建技術(shù)的抗肝癌單鏈抗體人源化抗體庫(kù)設(shè)計(jì)

葉剛劉麗1楊冬華湯紹輝周旻2丁世華韋宏成鐘健
(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東廣州510632)

〔摘要〕目的完成抗肝癌噬菌體單鏈抗體scFv DM的人源化設(shè)計(jì)，為進(jìn)一步構(gòu)建人源化抗肝癌噬菌體單鏈抗體庫(kù)奠定基礎(chǔ)。方法通過(guò)IgBlast搜索基因數(shù)據(jù)庫(kù)獲取鼠源抗體序列模板，從蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得結(jié)構(gòu)模板;在SGI圖形工作站上，通過(guò)InsightlⅡ軟件包進(jìn)行抗肝癌噬菌體單鏈抗體scFv DM的三維結(jié)構(gòu)模建，分析抗體氨基酸序列和分子結(jié)構(gòu)，確定影響抗原結(jié)合部位的框架區(qū)關(guān)鍵殘基。結(jié)果成功模建抗肝癌噬菌體單鏈抗體scFv DM的三維結(jié)構(gòu)，確定AAW67378、BAB18257分別為單鏈抗體scFv DM的重鏈和輕鏈框架區(qū)最佳人源化模板，確定了人源化殘基、回復(fù)突變的殘基，將可能影響抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的殘基的鼠源和人源副本編入到人源化抗體庫(kù)序列中。結(jié)論計(jì)算機(jī)輔助下的同源模建技術(shù)可為抗體人源化設(shè)計(jì)提供方案，為抗肝癌噬菌體單鏈抗體scFv DM同步實(shí)現(xiàn)人源化和優(yōu)化提供可能性。

〔關(guān)鍵詞〕同源模建;人源化;單鏈抗體;組合庫(kù);肝癌

1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院校門(mén)診部2廣州市腫瘤醫(yī)院化療科

第一作者:葉剛(1969-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事肝病的診治及教學(xué)研究。

目前，最常用的抗體人源化改造技術(shù)是抗體互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植法〔1〕。如果僅僅將鼠源CDR移植到人源抗體框架區(qū)(FR)，親本抗體的親和力常下降，特異性很難保持。研究結(jié)果顯示，將影響抗體互補(bǔ)決定區(qū)構(gòu)象的重要?dú)埢M(jìn)行突變，回復(fù)為鼠源殘基可使親本抗體的活性恢復(fù)〔2〕。需要解決的問(wèn)題是如何確定這些重要?dú)埢Ｑ芯繄?bào)道〔3〕，采用組合抗體庫(kù)人源化優(yōu)化法優(yōu)化一個(gè)鼠源單抗的FR重構(gòu)，恢復(fù)了抗體的活性。即選取同源性最高的序列作鼠可變區(qū)模板，分析三維結(jié)構(gòu)，列出可能影響和不影響抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)的重要?dú)埢瑢⒑笳呷嗽椿瑢?duì)前者則將對(duì)應(yīng)的鼠源和人源副本編入到一個(gè)序列中，構(gòu)建人源化抗體庫(kù)，篩選高親和力的單鏈抗體。我們課題組成功構(gòu)建鼠抗人肝癌噬菌體scFv庫(kù)，并篩選獲得1株特異抗肝癌的scFv(HscFv 4-16)，在GenBank的登錄號(hào)為DQ640759，進(jìn)而通過(guò)體外親和力成熟獲得高親和力的一株抗肝癌scFv(scFv DM)〔4〕。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)同步實(shí)現(xiàn)人源化和FR殘基優(yōu)化的組合抗體庫(kù)人源化優(yōu)化技術(shù)，對(duì)我們獲得的鼠源scFv DM進(jìn)行人源化改造，以獲得免疫原性低，保持親本親和力和特異性的人源化抗肝癌scFv，為今后在肝癌早期診斷和治療領(lǐng)域的發(fā)展提供新方法和手段。

1　材料和方法

1.1材料從本課題組獲得scFv DM的基因序列，采用Ig-Blast，從EMBL、GenBank、DDBJ和Kabat Database等基因數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鼠源抗體模板序列，從蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)獲取結(jié)構(gòu)模板坐標(biāo)，使用InsightlI軟件包(Accerly公司)進(jìn)行抗體三維結(jié)構(gòu)模建。

1.2方法

1.2.1鼠源抗體序列分析通過(guò)IgBlast搜索EMBL+Genbank+ DDBJ+Kabat Database數(shù)據(jù)庫(kù)，確定scFv DM抗體重鏈和輕鏈的CDR和FR模板序列，再進(jìn)行鼠源序列亞組分析，初步確定序列的罕見(jiàn)殘基。

1.2.2鼠源單鏈抗體三維結(jié)構(gòu)的模建通過(guò)InsightⅡ工作站進(jìn)行抗體三維結(jié)構(gòu)模建:從抗體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取鼠源抗體同源蛋白結(jié)構(gòu)，用HOMOLOGY軟件包比對(duì)抗體結(jié)構(gòu)，比較主鏈的碳原子Cα均方根位移(RMS)，進(jìn)行結(jié)構(gòu)疊合，分別確定RMS＜1?和RMS＞1?的區(qū)域?yàn)閰⒖嫉鞍椎慕Y(jié)構(gòu)保守區(qū)(SCR)和結(jié)構(gòu)可變區(qū)(LOOP區(qū)) ;賦值結(jié)構(gòu)保守區(qū)空間坐標(biāo);完成變異區(qū)模建和側(cè)鏈安裝;最后優(yōu)化模建結(jié)構(gòu)和合理化驗(yàn)證模建結(jié)構(gòu)〔5〕。

1.2.3FR區(qū)人源化模板的選擇通過(guò)IgBLAST，比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的人源抗體序列，確定同源性最高的5條人源抗體可變區(qū)模板序列，再評(píng)估胚系基因，同源性，CDR長(zhǎng)度一致性，回復(fù)突變數(shù)量等因素，最終確定FR區(qū)模板。

1.2.4鼠源抗體FR關(guān)鍵殘基的確定根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道〔6〕，以下FR殘基對(duì)抗原抗體結(jié)合部位的構(gòu)象:①結(jié)合位點(diǎn)外周殘基:通過(guò)InsightⅡ工作站，搜索模建的抗體三維結(jié)構(gòu)每個(gè)CDR的5?范圍空間;②輕鏈/重鏈相互作用部位的保守殘基:利用抗體三維結(jié)構(gòu)，結(jié)合Chothia的定義確定輕鏈/重鏈相互作用部位殘基;③正則結(jié)構(gòu)關(guān)鍵殘基;④游標(biāo)區(qū)(Vernier區(qū))的殘基;⑤罕見(jiàn)殘基。

1.2.5人源化抗體基因序列的設(shè)計(jì)把鼠源抗體CDR序列插入到已確定的人FR序列，比對(duì)FR序列，確定人、鼠間不同的殘基，然后將不能判定對(duì)抗原結(jié)合構(gòu)象是否重要的人源、鼠源氨基酸殘基均列入人源化抗體基因序列中。

2　結(jié)果

2.1鼠源單鏈抗體三維結(jié)構(gòu)的模建及結(jié)合位點(diǎn)周?chē)鷼埢拇_定H1A6W、H1IQW和H1QAX被確定為重鏈的結(jié)構(gòu)參考蛋白(三者的RMS為0.464?)，L1AY1、L1BQL和L2IFF被確定為輕鏈的結(jié)構(gòu)參考蛋白(三者的RMS為0.466?) ;按照前述的同源模建步驟進(jìn)行模建，獲得scFv DM的三維結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖1，圖2。通過(guò)Prostat合理化驗(yàn)證，模板1NQB的83％Φ和Ψ分布核心區(qū)域，模建三維結(jié)構(gòu)的為81％，證明預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)合理可靠。鼠源單鏈抗體結(jié)合位點(diǎn)周?chē)鷼埢?jiàn)圖3。

圖1　scFv DM的三維結(jié)構(gòu)(飄帶圖)

2.2CDR的確定及正則結(jié)構(gòu)關(guān)鍵殘基的確定根據(jù)模建的抗體分子三維結(jié)構(gòu)CDR的長(zhǎng)度確定正則結(jié)構(gòu)，繼而判定對(duì)保持CDR環(huán)結(jié)構(gòu)起重要作用的殘基，見(jiàn)表1。

圖2　scFv DM的三維結(jié)構(gòu)(線形圖)

圖3　抗原結(jié)合位點(diǎn)周?chē)鷼埢?/p>

表1　CDR環(huán)的劃分和正則結(jié)構(gòu)關(guān)鍵殘基(Kabat法編號(hào))

2.3VL/VH相互作用面的堆積殘基和Vernier區(qū)殘基利用抗體三維結(jié)構(gòu)，位于VL/VH相互作用部位的重要堆積殘基參照Chothia的定義確定，VH 10個(gè)(35、37、39、45、47、91、93、95、101、103)，VL 10個(gè)(34、36、38、44、46、87、89、91、96、98) ; Vernier區(qū)的氨基酸殘基構(gòu)成CDR的支撐結(jié)構(gòu)，確定為: VH 2 27-30 47-49 67 68 71 73 78 93-94 103; VL 2 4 35-36 46-49 64 66 68-69 71 98(以上殘基均按Kabat法編號(hào))。

2.4FR區(qū)人源化模板的選擇通過(guò)IgBLAST搜索工具，將鼠源scFv的重鏈和輕鏈分別所有人源抗體氨基酸序列作比較，將VH和VL的5條同源性最高的模板做候選模板，比較與鼠FR的同源性及可能需回復(fù)突變的殘基數(shù)，見(jiàn)表2。VL的候選模板中，2FEE同源性高達(dá)83.95％，但它不屬于胚系基因，因此排除。ABA26082、BAB18257和AAC41992的同源性均為71.6％，但需回復(fù)突變的殘基數(shù)目不同。VH的候選模板ABF83408和1JV5-B的同源性均為77.38％，但1JV5-B的多個(gè)FR長(zhǎng)度與鼠抗體不同，而ABF83408的CDR3比鼠抗體的多一位，因此均不適于做VH的FR模板。最后確定同源性較高且需回復(fù)突變殘基較少的BAB18257、AAW67378分別為VL和VH的FR區(qū)人源化模板。

表2　scFv DM的重鏈和輕鏈框架區(qū)候選模板比較

2.5組合庫(kù)優(yōu)化法人源化抗體序列的設(shè)計(jì)

2.5.1比對(duì)人、鼠FR的差異殘基比對(duì)VL和VH人、鼠FR序列，確定分別有23個(gè)和20個(gè)殘基不同，其中人源化殘基: L10T，L11L，L13L，L21L，L42Q，L43A，L72T，L76S，L77S，L78L，L80P，L83F，L84A，L85V，L106I; H7V，H9S，H11A，H14K，H22V，H40A，H42GH75I，H83R，H85D，H87T;應(yīng)該回復(fù)突變的殘基: L49N，L60A，L70D，L71F，H48M，H69M，H71R，H91Y;難以判斷對(duì)抗原結(jié)合作用的殘基: L22S，L58I，H5Q，H67V，H70T，H73T，H82AS，見(jiàn)圖4。

2.5.2編寫(xiě)抗體人源化序列將鼠源抗體CDR插入到已選擇好的人FR，將不易確定回復(fù)突變影響的7個(gè)殘基的鼠、人源副本都編寫(xiě)入鼠人組合抗體庫(kù)中(以鼠/人表示) : MAQV(Q/ K )LVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYISTSYDIDWVRQAPGQGL-EWIGWIFPGEGSTEYNEKFKGR (V/A) TL (T/S) VD (T/K) SISTAYMEL (S/T) RLRSDDTAVYFCARGDYYRLYFDLWGQGTTVTVSS-GGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPA TLSLSPGERATL (S/T ) CSASSSTRYIYWYQQKPGQAPRLLIYDTSNVAPG(I/V) PFRFSGSGSGTSYTLTISSLEPEDFAVYYCQERSGYPYTFGGGTKLE IKR。

圖4　重鏈和輕鏈的框架區(qū)模板序列及關(guān)鍵殘基比對(duì)

3　討論

制備人源抗體或人源化抗體是克服鼠源抗體產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA)反應(yīng)的兩種常用方法。但目前制備親和力高、特異性強(qiáng)的人源抗體較為困難，所以人源化改造鼠源抗體仍然是我們獲取治療性抗體的重要方法。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)InsightⅡ軟件包，對(duì)特異性抗肝癌scFvDM進(jìn)行同源模建，獲得抗體的三維結(jié)構(gòu)，為人源化抗體序列設(shè)計(jì)的優(yōu)化提供基礎(chǔ)。

劃定抗體的CDR和FR是設(shè)計(jì)人源化抗體序列的首要步驟。通用的CDR的劃定法有: Kabat序列劃分法和Chothia結(jié)構(gòu)劃分法。按Kabat劃分法，CDRH2是H50-H65，而Chothia劃分法確定的CDRH2是H52-56。Chothia劃分法確定的CDR區(qū)較前一種方法的短，使得CDR移植后的抗體中的鼠源成分存留相應(yīng)較少，可降低免疫反應(yīng)。但正確劃定CDR還是保持人源化抗體親和力的重要一步。Kabat定義的CDRH2中只有H50～H58殘基與抗原接觸〔7〕。有研究〔8〕報(bào)道，因未將H59～H65部位殘基劃入CDRH2而移植到人源化抗體中，親和力較親本抗體降低了1 000多倍。因此，本實(shí)驗(yàn)中我們采用Kabat劃分法，人源化抗體的CDRH2為H50～H65，以保持親和力。對(duì)CDRH1的劃分，采用Kabat法為H31～35B，在分析模建的抗體三維結(jié)構(gòu)，H30是I，因而，我們將人源化抗體的CHDH1調(diào)整為H30～H35B，力求劃分準(zhǔn)確。

人FR模板的選擇是抗體人源化的第二個(gè)關(guān)鍵步驟。FR不僅參與CDR的空間構(gòu)象，還對(duì)抗體結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)象的形成有影響，有時(shí)還參與抗原的結(jié)合〔6〕。簡(jiǎn)單的CDR移植常常使抗體親和力降低甚至喪失。共有序列、非胚系基因和胚系基因均可選擇。共有序列是人造的序列，有不含特異反應(yīng)性氨基酸殘基的優(yōu)勢(shì)，但終究是人造的，故棄用。在5條同源性最高的候選模板中，2FEE同源性最高(83.95％)，但屬于非胚系基因。非胚系基因可能帶有未知的體細(xì)胞突變，而產(chǎn)生免疫原性，因此改選同屬于一個(gè)胚系KappaⅢ亞組的AAW67378做模板。

確定FR的關(guān)鍵殘基是人源化抗體的另一個(gè)重要步驟。因?yàn)闃?gòu)成抗體FR的殘基對(duì)抗原結(jié)合、FR折疊(內(nèi)部堆積)和穩(wěn)定CDR構(gòu)象等方面的重要性并不相同。按重要性大小可將構(gòu)成抗體FR殘基分為三類(lèi)〔9〕:高風(fēng)險(xiǎn)性殘基指直接參與抗原的結(jié)合、穩(wěn)定FR折疊或CDR構(gòu)象的殘基。替換在這些位置的殘基，會(huì)降低人源化抗體的活性。實(shí)驗(yàn)還證明，將FR區(qū)的關(guān)鍵殘基回復(fù)突變對(duì)抗體親和力的恢復(fù)有重要影響，甚至可使抗體的分泌表達(dá)量增加〔10〕。暴露于溶劑而對(duì)抗體結(jié)構(gòu)和抗原結(jié)合影響少的殘基屬于低風(fēng)險(xiǎn)殘基，將它們替換能降低免疫原性而幾乎對(duì)抗體的親和力無(wú)影響;而有選擇地替換中度風(fēng)險(xiǎn)性殘基，則有可能使人源化抗體的親和力提升。

本文比較鼠源抗體重鏈FR區(qū)和模板序列，發(fā)現(xiàn)有20個(gè)不同殘基。首先確定不可替換的高風(fēng)險(xiǎn)殘基:與抗原接觸的殘基、正則結(jié)構(gòu)關(guān)鍵殘基，“游標(biāo)區(qū)”的殘基。結(jié)合三維結(jié)構(gòu)看，PheH91 和LeuH69均屬于抗原接觸殘基，可能影響CDR的構(gòu)象，因此我們決定將它們劃入回復(fù)突變殘基。IleH48(Kabat編號(hào))為“游標(biāo)區(qū)”(vernier zone)殘基，ValH71是正則結(jié)構(gòu)殘基，均需保留。

鼠源抗體輕鏈和模板的FR區(qū)比對(duì)，共有23個(gè)不同殘基。TyrL71屬于正則結(jié)構(gòu)殘基，確定回復(fù)突變?yōu)槭笤礆埢erL70，PheL60和TyrL49均為CDR外周5?范圍殘基。TyrL49緊靠CDRL2，分析三維結(jié)構(gòu)，它的芳香環(huán)側(cè)鏈伸向抗原結(jié)合位點(diǎn)。許多人源化研究〔11，12〕均將確定為回復(fù)突變。H5，H67，H70，H73，H82a，L22和L58雖然都屬于CDR外周5?范圍的殘基，但人FR相對(duì)應(yīng)殘基的疏水性與它們相當(dāng)，甚至更高，難以確定是否應(yīng)該回復(fù)突變，因此，將鼠源和人源殘基的核酸密碼子作為簡(jiǎn)并密碼，都編進(jìn)人源化抗體序列中。

本研究成功模建抗肝癌噬菌體單鏈抗體scFv DM的三維結(jié)構(gòu)，選擇BAB18257和AAW67378分別為單鏈抗體scFv DM的輕鏈(VL)和重鏈(VH)框架區(qū)(FR)最佳人源化模板，確定了回復(fù)突變殘基、人源化殘基和難以判斷殘基，完成人源化抗體序列的設(shè)計(jì)。擬進(jìn)一步采用噬菌體展示技術(shù)，構(gòu)建人源化組合抗體庫(kù)，利用噬菌體抗體庫(kù)強(qiáng)大的篩選功能，獲取高親和力的人源化抗肝癌單鏈抗體。

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〔2015-01-17修回〕

(編輯苑云杰/曹夢(mèng)園)

通訊作者:鐘健(1961-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事消化系統(tǒng)疾病的診治及教學(xué)研究。

基金項(xiàng)目:廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目基金(No．2013B022000075) ;廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省科研課題(20131152) ;廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(A2011336) ;廣東省科技計(jì)劃基金項(xiàng)目(No．2006B19901014)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R735.7

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015) 16-4467-04;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.021