人工重組促紅細胞生成素對激素沖擊大鼠股骨頭壞死的預防作用

蔣魯勇　顏勇卿　余　霄　龐清江(寧波大學醫學院，浙江　寧波　352)

人工重組促紅細胞生成素對激素沖擊大鼠股骨頭壞死的預防作用

蔣魯勇顏勇卿1余霄1龐清江1
(寧波大學醫學院，浙江寧波315211)

〔摘要〕目的探討人工重組促紅細胞生成素(rHuEPO)對激素沖擊大鼠缺血性股骨頭壞死的預防作用。方法健康成年Wistar大鼠24只，雌雄各半。隨機分為三組。陽性對照組:大鼠后腿肌注地塞米松(Dex) 1 mg/kg體重(BW)，2次/w，連續5 w;陰性對照組:同樣方法注射生理鹽水;實驗組:大鼠后腿肌注Dex 1 mg/kg BW，2次/w，連續5 w，并且每日腹腔內注射500 U/kg體重rHuEPO至5 w。制模后全部處死取材，取雙側股骨頭標本，一側切片后HE染色，并用光學顯微鏡觀察骨組織、骨髓組織、骨小梁結構變化。另一側切片后免疫組化法CD31染色觀察微血管變化。結果陽性對照組HE染色發現骨小梁明顯稀疏、變窄，形態不規則，骨小梁分割程度下降并伴有較多破骨細胞出現，部分可見骨細胞胞核皺縮、溶解、消失。而實驗組較陽性對照組，病變明顯減輕，骨小梁形態較為規則，小梁連接程度明顯優于陽性對照組，部分骨小梁較粗，斷裂明顯減少，骨小梁分割程度較高且可見較多成骨細胞。免疫組化測CD31顯示陽性對照組CD31表達要明顯低于陰性對照組與實驗組(P＜0.05)。結論rHuEPO可以有效地預防骨細胞凋亡，延緩或降低股骨頭壞死的發生。

〔關鍵詞〕人工重組促紅細胞生成素;激素;股骨頭壞死

1寧波第二醫院骨科中心

第一作者:蔣魯勇(1988-)，男，碩士，住院醫師，主要從事骨關節疾病研究。

激素性股骨頭壞死(SANFH)不僅起病快，進程快，預后差，而且還具有易致股骨頭塌陷及致殘率高等臨床特點。SANFH發病的最終因素是其股骨頭內部出現供血不足的現象，并且血運重建受到障礙，最終造成骨細胞壞死〔1～4〕。因此，治療股骨頭缺血性壞死的關鍵就是促進壞死區血管再生和新骨形成。促紅細胞生成素(EPO)是一種分子量約30 kD、熱穩定(80℃)的單鏈酸性糖蛋白。研究證實，EPO不但能夠有效促進紅細胞生成，同時還有保護細胞的作用，特別是能夠阻止內皮細胞、神經細胞和心肌細胞凋亡，促進新生血管的生成〔5〕。本研究旨在探討人工重組(rHu) EPO對激素沖擊大鼠缺血性股骨頭壞死的預防作用。

1　材料與方法

1.1大鼠激素性股骨頭缺血性壞死模型的建立健康成年Wistar大鼠24只，雌雄各半，體重約為300 g。均在同一條件下飼養，均采用普通顆粒飼料，采取自然光照，溫度(20±2)℃，濕度50％左右。1 w后稱重，隨機分為陽性對照組、陰性對照組、實驗組，每組8只，雌雄各半。3組體重無統計學差異(P＞0.05)。均符合2006年科學技術部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。陽性對照組:后腿肌注地塞米松(Dex) 1 mg/kg體重，2次/w，連續用藥5 w;陰性對照組同樣方法注射等量生理鹽水;實驗組后腿肌注Dex 1 mg/kg體重，2次/w，連續5 w，并且每日腹腔內注射500 U/kg體重rHuEPO至5 w。

1.2大體觀察每天注意觀察生命狀態、進食情況、體重、精神狀態、排泄情況及有無體表感染等，準確稱重。為了增加動物的活動量，實行每天定時活動2 h，盡可能使模型的建立更加合理。

1.3HE染色5 w后各組麻醉后放血處死，切取雙側股骨頭標本用于HE染色及免疫組化檢測CD31。進行取材標本時小心剔除周圍軟組織，仔細注意股骨頭是否光滑完整，形態是否正常及冠狀面的色澤、切開時阻力大小等等。將所取標本用10％中性甲醛溶液(0.1 mol/L，pH7.4) 4℃固定4 d，然后PBS溶液沖洗，放在緩沖液大約10％乙二胺四乙酸(EDTA-Tris)溶液里，37.4℃脫鈣，該方法實行每周1次，仔細注意骨表面的顏色，并且采用物理法準確測量脫鈣程度。如果完全脫鈣后進行取材，乙醇對梯度逐級脫水，二甲苯透明處理2 h，用石蠟包埋，切開片面后行HE染色。利用在光學顯微鏡下觀察骨組織、骨髓組織、骨小梁結構變化。

1.4免疫組化測定CD31取相應的股骨頭標本，沿冠狀面縱行剖開，給予多聚甲醛固定液大約40 g/L中，放在4℃冰箱內，放置48 h，石蠟切片SP免疫組化。CD31陽性信號定位于血管內皮細胞質，呈棕黃色顆粒。在顯微鏡下觀察，隨機抽取3個每張免疫組化切片不同視野(×400)計數呈棕黃色的陽性表達血管。

1.5統計學方法采用SPSS18.0統計學分析軟件對數據的組間比較進行t檢驗。

2　結果

2.1一般情況各組大鼠狀態良好。5 w后陽性對照組和實驗組大部分后肢和背部毛發脫落、稀疏;而陰性對照組毛發無明顯改變。整個實驗期間，無動物死亡，陽性對照組有部分動物活動減少，食欲可;其余兩組未見明顯異常。

2.2HE染色結果①陰性對照組:雄性和雌性大鼠骨小梁結構完整，呈圓形或橢圓形拱形結構，骨小梁連接性高，骨髓造血細胞豐富，脂肪細胞相對少，無破骨細胞和骨小梁變窄、斷裂出現。②陽性對照組:雄性中3只大鼠可見骨小梁明顯稀疏、變窄、斷裂、連接率降低，部分拱形結構消失，形態不規則，骨小梁分割程度下降并伴有較多破骨細胞出現，部分可見骨細胞核皺縮、溶解、消失;雌性中有3只可見上述病變。其他2只均有不同程度的骨小梁變窄、連接率降低等病變產生。③實驗組:較陽性對照組，雄性和雌性病變明顯減輕，骨小梁形態較為規則，小梁連接程度明顯優于陽性對照組，部分骨小梁變粗，斷裂明顯減少，缺損處出現連接和修復，部分結構接近正常組，骨小梁分割程度較高且可見較多成骨細胞。見圖1。

圖1　各組股骨頭的組織病理學變化

2.3免疫組化檢測CD31的表達CD31抗體免疫組化染色能清晰地選擇性地顯示血管內皮細胞，呈棕黃色顆粒，而其他組織不著色。顯微鏡下隨機視野計數血管染色后。與陰性對照組和實驗組比較，陽性對照組CD31低表達，見表1。①陰性對照組: CD31表達豐富，股骨頭血供充足，微循環正常;②陽性對照組: CD31染色計數明顯減少，棕黃色較淡，提示微循環不足，股骨頭血供下降明顯(P＜0.001) ;③實驗組:相比陽性對照組CD31染色計數增多，血供相對增加(P＜0.05)。見圖2。

表1　各組股骨CD31的表達染色計數(±s，n=4)

表1　各組股骨CD31的表達染色計數(±s，n=4)

與陰性對照組比較: 1) P＜0.001;與陽性對照組比較: 2) P＜0.05，3) P＜0.01

組別　　雄　　雌陰性對照組　26.00±6.02　27.67±7.99陽性對照組　12.72±3.391)　14.11±5.021)實驗組　15.61±3.132)　18.94±4.223)

圖2　各組免疫組化檢測CD31結果(×400)

3　討論

胡長根等〔6〕發現激素可誘導微血管內皮細胞的凋亡引起毛細血管數量減少，可能誘導微循環障礙。當長期大劑量使用糖皮質激素時，隨著股骨頭微血管密度(MVD)的下降，血流灌注量逐漸減少，股骨頭血流量逐漸下降，隨著血流量用藥時間的延長而進一步降低。導致骨組織細胞缺血，發生缺氧及各系細胞發生脂肪變性。當缺血和缺氧到達某一閾值時即發生骨壞死。目前有多種保頭的治療方法，其中髓芯減壓是目前比較常用的方法。該方法的主要機制在于能夠逐漸恢復股骨頭的血液循環，減少股骨頭內的壓力，采用髓芯鉆孔減壓，能夠減輕骨髓水腫同時還能有效改善股骨頭血液循環、最終達到治愈疾病的目的。

EPO能夠促進網織紅細胞和內皮細胞的增殖分化，刺激形成血管及再生細胞，具有抗細胞凋亡、抗炎、抗氧化、血管生成及促進細胞增殖和保護作用。一方面EPO能夠抗氧化、抗細胞凋亡、調節炎癥反應、減輕心腎組織損傷和促血管新生等多方面的骨髓造血以外的功能，另一方面，增加紅細胞生成來提高組織氧灌注，因此影響慢性心力衰竭和腎功能不全的組織重塑和纖維化進程〔5，7〕。研究表明，心力衰竭伴貧血的患者，使用EPO治療貧血可能改善心功能，降低其住院率〔8〕。張嘉熙等〔9〕通過體外培養小鼠骨髓基質細胞系(ST2)，加入EPO后，采用實時PCR方法檢測成骨細胞相關基因的表達，結果顯示EPO組與對照組相比，鈣沉積明顯增多，成骨相關基因的表達也增高，得出EPO對成骨細胞的分化和功能有明顯的促進作用。Hu等〔10〕發現EPO可通過抑制p38MAPK活化、降低腫瘤壞死因子(TNF) -α水平、減輕炎性損傷等顯著改善大鼠腎臟缺血再灌注損傷后的腎功能異常，對腎移植后早期腎功能恢復提供了幫助。Ishii等〔11〕發現EPO預處理可減少腦梗死面積和神經細胞凋亡的數量，從而減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。Ahn等〔12〕研究表明EPO能促進血管生成、改善血液流動，能有效改善小鼠下肢循環，為臨床恢復急性動脈栓塞后的血液灌注提供新的思路和實驗依據。本實驗說明rHuEPO可以減少骨細胞凋亡，進而阻止股骨頭壞死的發生。由此推測rHuEPO可能通過微循環的改善，實現預防股骨頭壞死。采用rHuEPO進行治療，短期效果明顯，但是長期療效和預防作用的機制還需深入探討。

4　參考文獻

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〔2014-06-19修回〕

(編輯苑云杰)

通訊作者:龐清江(1963-)，男，博士，碩士生導師，主任醫師，主要從事人工關節、骨質疏松研究。

基金項目:浙江省自然科學基金資助項目(No．LY12H06002)

〔中圖分類號〕R68

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4471-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.022