褪黑素對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠ERK-MAPK信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的影響

劉寶華　李海峰　胡克邦　劉海波(吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部，吉林　長(zhǎng)春　130031)

褪黑素對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠ERK-MAPK信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的影響

劉寶華李海峰胡克邦劉海波
(吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部，吉林長(zhǎng)春130031)

〔摘要〕目的探討褪黑素(MT)對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)急性期ERK-絲裂原活化蛋白酶(ERK-MAPK)信號(hào)通路的影響。方法制作大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型，打擊損傷前30 min自尾靜脈注射MT。細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)(TUNEL)熒光法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western印跡法檢測(cè)損傷腦皮質(zhì)pERK表達(dá)水平。結(jié)果TUNEL熒光法檢測(cè)顯示TBI+MT組損傷灶周?chē)覶UNEL陽(yáng)性細(xì)胞少于TBI組，凋亡指數(shù)降低(P＜0.05)。Western印跡法檢測(cè)腦損傷后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)pERK表達(dá)，在損傷后1 h起迅速升高，3 d為表達(dá)高峰，其后逐漸下降，但直到損傷后5 d仍未恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。TBI+MT組pERK水平較TBI組明顯降低(P＜0.01)，而且MT 20 mg/kg組的pERK1/2水平低于10 mg/kg組(P＜0.05)。結(jié)論創(chuàng)傷性腦損傷誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的ERKMAPK信號(hào)通路激活，MT能夠劑量依賴(lài)性抑制ERK1/2-MAPK信號(hào)通路激活，并抑制急性期神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

〔關(guān)鍵詞〕創(chuàng)傷性腦損傷; MAPK;信號(hào)傳導(dǎo)

第一作者:劉寶華(1977-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事急重癥醫(yī)學(xué)的研究。

交通事故、意外傷害所致的創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)的發(fā)生率逐年升高，主要的病理生理機(jī)制是缺血性腦損傷和繼發(fā)的遲發(fā)性損傷，其死亡率和致殘率高，然而臨床安全和有效的干預(yù)措施仍有待于進(jìn)一步的研究。褪黑素(MT)是普遍存在于生物體的一種吲哚胺類(lèi)激素、進(jìn)化保留因子，在體內(nèi)引起多種生物效應(yīng)，包括調(diào)節(jié)生物節(jié)律、神經(jīng)內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)等重要作用〔1〕。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)MT具有很強(qiáng)的自由基清除作用及抗氧化作用，本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察MT對(duì)TBI大鼠絲裂原活化蛋白酶(MAPK)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的影響及變化，旨在探討MT的腦保護(hù)作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1試劑MT: Alexis公司產(chǎn)品，使用前先溶于無(wú)水乙醇，繼以生理鹽水稀釋。細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)(TUNEL)試劑盒為瑞士Roche公司產(chǎn)品，兔抗phospho-ERK1/2抗體(1∶800，Cell Signaling，美國(guó))、兔抗ERK1/2抗體(1∶800，Cell Signaling，美國(guó))。

1.2大鼠TBI模型的建立選用成年健康SD大鼠125只，每只約250～300 g，雌雄兼用，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。自然光照周期飼養(yǎng)，術(shù)前12 h禁食，自由飲水。SD大鼠稱(chēng)重后經(jīng)2％戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后，俯臥固定于腦立體定位儀上。矢狀中線(xiàn)切開(kāi)頭皮后分離骨膜，暴露前囟、冠狀縫和矢狀縫及頂骨。以前囟后310 mm，向右旁開(kāi)矢狀縫310 mm為中心作一直徑約為4～5 mm顱骨鉆孔。保持硬腦膜不受損傷。采用Feeney法制作大鼠中度腦損傷模型，落體致傷的沖擊力為40 g×25 cm。將自由落體裝置底座置于右頂骨窗部的硬腦膜表面，以40 g重物自25 cm高沿套管下落打擊致傷，造成右頂局限性損傷。

1.3動(dòng)物分組125只大鼠隨機(jī)分為5組，每組25只:①假手術(shù)(Sham)組:手術(shù)操作同其他組，但僅作頭皮切口，開(kāi)顱骨窗不致腦損傷;②TBI組:于損傷前30 min靜脈注射等體積生理鹽水;③TBI + MT 5 mg/kg (MT5)組;④TBI + MT 10 mg/kg (MT10)組;⑤TBI+MT 20 mg/kg(MT20)組。③～⑤組于外傷前30 min靜脈注射MT 1次。TBI組和TBI+MT組又按取材時(shí)間的不同分為傷后1、6 h、1、3、5 d共5個(gè)分析時(shí)相點(diǎn)，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)5只。

1.4TUNEL熒光法檢測(cè)細(xì)胞凋亡取經(jīng)TBI區(qū)域皮質(zhì)，新鮮冰凍切片制備連續(xù)冠狀切片(厚度5 mm)，按德國(guó)BM公司TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，進(jìn)行切片的TUNEL熒光染色。光鏡下監(jiān)測(cè)染色。每個(gè)切片觀(guān)察受傷灶中心皮質(zhì)、皮層下白質(zhì)、海馬、齒狀回及對(duì)側(cè)相應(yīng)部位腦組織，細(xì)胞核著綠色熒光(TUNEL陽(yáng)性)和藍(lán)色熒光(DAPI陽(yáng)性)者為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。熒光顯微鏡下(10目鏡×20物鏡)每張切片隨機(jī)選取3個(gè)無(wú)重疊視野，采用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件分別計(jì)數(shù)DAPI染色陽(yáng)性細(xì)胞和TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI) (％)，即凋亡細(xì)胞占視野總細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.5Western印跡檢測(cè)TBI腦組織pERK1/2表達(dá)在各個(gè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)大鼠以10％水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，快速斷頭取腦，冠狀切取頂葉皮層約100 mg，迅速剪碎，加入1 ml細(xì)胞裂解液，冰浴中勻漿，4℃，12 000 r/min離心15 min，取上清液，Bradford法測(cè)定蛋白濃度。加入等體積2×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，煮沸10 min，10 000 r/min離心5 min。取樣本30 μg進(jìn)行10％聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到聚偏氟丙烯(PVDF)膜，麗春紅染色觀(guān)察轉(zhuǎn)移效果，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白確定待測(cè)蛋白的條帶位置。含5％脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液(PBS)液封閉2 h，按0.5 μg/ml濃度加入兔抗pERK1/2多克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜，加入羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG(1∶2 000)，室溫?fù)u育1 h，洗滌后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑暗室內(nèi)膠片曝光。用Gelwork4.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定目的條帶的吸光度值。以β-tublin(47 kD)為內(nèi)參照，根據(jù)目的條帶與β-tublin條帶吸光度的比值表示待測(cè)蛋白含量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)的組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1TUNEL熒光法檢測(cè)MT對(duì)TBI后細(xì)胞凋亡影響情況TBI后1 h～5 d細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示，對(duì)照組(Sham組)和損傷組(TBI組)對(duì)側(cè)腦組織未見(jiàn)或僅有極少量的凋亡細(xì)胞。壞死細(xì)胞(Ⅰ型細(xì)胞)主要集中在傷灶中心皮質(zhì)，片狀分布;凋亡細(xì)胞(Ⅱ型細(xì)胞)呈散在分布，相對(duì)集中于傷灶與正常組織交界的皮層、皮層下白質(zhì)、海馬和齒狀回。傷后1 h傷側(cè)腦組織即出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，AI值與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)，并隨時(shí)間延長(zhǎng)數(shù)量逐漸增多，其峰值出現(xiàn)在1 d，隨后緩慢下降，但5 d時(shí)仍高于正常水平。TBI組較Sham組AI顯著提高(P＜0.01)，而TBI +MT組較TBI組損傷灶周?chē)べ|(zhì)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞少于TBI組，AI顯著降低(P＜0.05)，其中TBI+MT20組降低程度最明顯(P＜0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1　TUNEL檢測(cè)MT對(duì)TBI后細(xì)胞凋亡的影響

2.2Western印跡檢測(cè)MT對(duì)TBI各組pERK1/2在腦組織內(nèi)表達(dá)的影響pERK1/2表達(dá)水平在TBI后顯著升高，并且在1 h和6 h持續(xù)高表達(dá)。TBI后MT治療組pERK1/2水平較TBI組明顯降低(P＜0.01)，MT 20 mg/kg組的pERK1/2水平低于10 mg/kg組(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2　Western印跡檢測(cè)MT對(duì)TBI各組PERK1/2在腦組織內(nèi)表達(dá)的影響

3　討論

TBI是一類(lèi)嚴(yán)重的閉合性腦損傷，具有較高死亡率和致殘率，其急性期治療的重點(diǎn)在于減輕繼發(fā)性腦損傷的程度。繼發(fā)性腦損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，包括興奮性氨基酸釋放、炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路激活和細(xì)胞凋亡等。這些病理變化的產(chǎn)生和發(fā)展都需要經(jīng)過(guò)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)完成，因此從細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)來(lái)下調(diào)過(guò)度的細(xì)胞反應(yīng)可能會(huì)為T(mén)BI的治療提供新的思路。

近期研究發(fā)現(xiàn)，ERK-MAPK通路在局灶性顱腦損傷、腦缺血的繼發(fā)病理改變中發(fā)揮了重要作用〔2〕。ERK1/2通路是將細(xì)胞外信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)的重要通路之一，各種細(xì)胞外信號(hào)先作用于細(xì)胞表面的受體，依次激活Ras、Raf-1及MEK，并進(jìn)一步將ERK1/2磷酸化，pERK1/2從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，調(diào)節(jié)即刻反應(yīng)基因和晚反應(yīng)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的狀態(tài)和功能。其中ERK1/2處于關(guān)鍵環(huán)節(jié)，可通過(guò)被磷酸化而活化，pERK1/2的表達(dá)可反映ERK1/2通路的活化水平。

ERK1/2磷酸化可以激活前凋亡轉(zhuǎn)錄因子，與其早期基因介導(dǎo)炎癥和凋亡有關(guān)。MT是一種強(qiáng)效自由基清除劑，可以有效對(duì)抗氧離子和ONOO－〔3〕。電生理學(xué)研究證實(shí)其可以抑制大腦內(nèi)N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體介導(dǎo)的活性。通過(guò)氧化還原反應(yīng)阻止nNOS活性和NO產(chǎn)生〔4〕。ERK1/2在TBI后被激活，其磷酸化過(guò)程收到細(xì)胞因子和自由基調(diào)控，可以緩解缺血損傷，而ERK1/2活性由外源性刺激產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)選擇性突觸外NMDA受體激活不激活體外ERK途徑，但可以誘導(dǎo)維持ERK激活狀態(tài)〔5〕。

本研究提示MT可以劑量依賴(lài)性抑制ERK1/2信號(hào)通路激活，并抑制急性期神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)腦組織避免繼發(fā)性損傷。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在TBI的分子學(xué)機(jī)制中發(fā)揮了一定作用，MT可以有效抑制MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活，對(duì)TBI具有一定的保護(hù)作用。

4　參考文獻(xiàn)

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〔2014-12-11修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者:劉海波(1972-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事急重癥醫(yī)學(xué)的研究。

基金項(xiàng)目:吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部科研專(zhuān)項(xiàng)基金(2013年)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R651.1

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015) 16-4473-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.023