膽汁酸衍生物INT-767激活FXR及TGR5降低小鼠動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)

張秉全　禹　晶　梁　波　林佰艷　鮑紅光(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，黑龍江　齊齊哈爾　161006)

膽汁酸衍生物INT-767激活FXR及TGR5降低小鼠動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)

張秉全禹晶梁波林佰艷鮑紅光
(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾161006)

〔摘要〕目的探討膽汁酸衍生物INT-767激活FXR及TGR5及其對(duì)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)的影響。方法選取8周齡載脂蛋白(Apo) E-/-和低密度脂蛋白(LDL) R-/-的C57BL/6J小鼠分別用含INT-767(30 mg/kg)高純度飼料(D12079B)喂養(yǎng)12 w和16 w，收集樣本后進(jìn)行組織生化分析(主動(dòng)脈竇組織生化分析)，對(duì)CD68和MCP1進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，血清樣本進(jìn)行快速蛋白液相色譜分析;血清膽汁酸水平通過qTRAP LC-MS/MS法檢測(cè)。血清炎性細(xì)胞因子水平通過酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒檢測(cè)。采用電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)測(cè)定核轉(zhuǎn)錄因子(NF) -κB與DNA的結(jié)合活性。結(jié)果INT-767可降低ApoE-/-和LDLR-/-小鼠血清膽固醇和甘油三酯水平，抑制肝CYPB1表達(dá)下調(diào)血清膽酸和去氧膽酸水平，從而抑制LDLR-/-和APOE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成、降低ApoE-/-小鼠巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥水平; INT-767主要是通過激活TGR5降低巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)水平。結(jié)論膽汁酸的類似物INT-767可通過雙激活TGR5和FXR調(diào)控靶基因，降低和減緩動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)。

〔關(guān)鍵詞〕膽汁酸衍生物; INT-767;法尼醇X受體; TβR5'端編碼序列;動(dòng)脈粥樣硬化;風(fēng)險(xiǎn)分析

第一作者:張秉全(1979-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事循環(huán)系統(tǒng)疾病研究。

膽汁酸作為信號(hào)分子主要通過兩個(gè)受體發(fā)揮作用，法尼醇X受體(FXR)和TβR5'端編碼序列(TGR5)，F(xiàn)XR是一個(gè)核受體，可通過鵝去氧膽酸激活，主要分布于肝臟，腎臟和腸道，并控制脂肪和碳水化合物的代謝〔1〕。通過FXR特異性激動(dòng)劑活化可抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展〔2〕。TGR5(也稱GPBAR1或MBAR)是一種G蛋白耦聯(lián)膽汁酸受體，高表達(dá)于小腸和膽囊，尤其是CD14陽(yáng)性單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面，可被初級(jí)和次級(jí)膽汁酸激活，但與石膽酸(LCA)具有最高的親和力〔3〕。TGR5介導(dǎo)膽汁酸代謝作用，刺激膽囊充盈，并提高胰島素敏感性，激活免疫抑制作用〔4〕。TGR5藥理活化引起的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，是通過減少巨噬細(xì)胞炎癥和脂質(zhì)的吸收〔5〕。已有報(bào)道一些膽汁酸及其類似物通過不同的機(jī)制引起的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用〔6〕，推測(cè)可能是通過FXR和TGR5雙受體激活預(yù)防了動(dòng)脈粥樣硬化形成。本研究使用一種新的FXR和TGR5雙受體激動(dòng)劑INT-767檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，發(fā)現(xiàn)可以降低循環(huán)血脂，并通過蛋白激酶A介導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子(NF) -κB失活減輕炎癥反應(yīng)，從而強(qiáng)烈減輕動(dòng)脈粥樣硬化形成。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物選取8周齡載脂蛋白E(ApoE) -/-和低密度脂蛋白(LDLR) -/-的C57BL/6J小鼠分別用含INT-767(30 mg/kg)高純度飼料(D12079B)〔7〕喂養(yǎng)12 w和16 w，每組8只雄鼠。所有小鼠通過禁食4 h后吸入異氟醚處死并收集樣本。

1.2組織生化分析對(duì)各組小鼠的主動(dòng)脈竇進(jìn)行組織生化分析，并對(duì)主動(dòng)脈根部組織CD68和1-甲基環(huán)丙烯(MCP1)進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，并對(duì)血清樣本進(jìn)行快速蛋白液相色譜(FPLC)分析。血清膽汁酸水平通過qTRAPLC-MS/MS法檢測(cè)。血清炎性細(xì)胞因子水平通過酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(R＆D)檢測(cè)。采用電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)測(cè)定NF-κB與DNA的結(jié)合活性(Promega)。

1.3細(xì)胞處理J774.2和Raw294.7巨噬細(xì)胞采用10 μg/ml 的INT-767和cAMP依賴蛋白激酶(PKA)抑制劑(Rp-8-BrcAMPS，Santa Cruz Biotechnology)預(yù)處理1 h，然后加入100 ng/ml的脂多糖(LPS)刺激不同時(shí)間，F(xiàn)XR和TGR5的過表達(dá)采用Raw294.7巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染含有FXR或TGR5 pcDNA3重組質(zhì)粒。采用G418(250 μg/ml)篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析和Newman-Keuls分析。

2　結(jié)果

2.1INT-767降低ApoE-/-和LDLR-/-小鼠血清膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平INT-767處理ApoE-/-小鼠組體重明顯下降(圖1A)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)附睪，腹膜后和皮下的白色脂肪組織重量均顯著減少(圖1B)。與對(duì)照組相比，INT-767處理ApoE-/-小鼠顯著降低血清TC和TG水平。脂蛋白分析顯示TC水平降低主要是極低密度脂蛋白(VLDL)和HDL降低，而非LDL和IDL水平降低(圖1C和1D)。

FXR和TGR5雙重激活的降脂作用也在LDLR-/-小鼠中得到驗(yàn)證，結(jié)果類似于APOE-/-小鼠，INT-767減少高純度飼料飲食誘導(dǎo)的LDLR-/-小鼠體重增加(圖2A)，也減少高脂飲食誘導(dǎo)LDLR-/-的小鼠肥胖風(fēng)險(xiǎn)(圖2B)。同時(shí)INT-767可以降低LDLR-/-小鼠血清TC、TG水平，脂蛋白分析表明INT-767可降低小鼠VLDL/LDL/IDL TC水平，也顯著降低VLDL TG水平(圖2C、圖2D)。

2.2INT-767抑制肝CYP8B1表達(dá)下調(diào)血清膽酸和去氧膽酸水平對(duì)APOE-/-小鼠肝臟FXR下游基因，如CYP7A1，CYP8B1 SR-BI、ABCB4的mRNA水平進(jìn)行分析以確定INT-767是否活化FXR，發(fā)現(xiàn)INT-767顯著減少膽汁酸合成所需的酶類CYP8B1和CYP7A1 mRNA水平，同時(shí)顯著升高SR-BI和ABCB4 mRNA水平(圖3A)。采用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析膽汁酸循環(huán)水平發(fā)現(xiàn)，INT-767顯著降低正常小鼠血清膽酸，脫氧膽酸和?；墙Y(jié)合型代謝產(chǎn)物水平，而在APOE-/-小鼠肝臟中鵝去氧膽酸和牛磺結(jié)合型代謝產(chǎn)物水平不變或增加(圖3B)。

2.3INT-767抑制LDLR-/-和APOE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成蘇丹Ⅳ染色顯示，與對(duì)照組小鼠比較，INT-767可顯著減少小鼠動(dòng)脈粥樣硬化水平，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊量降低81％(圖4) ; LDLR-/-接受16 w INT-767喂養(yǎng)后，動(dòng)脈粥樣硬化病變減少72％(圖5)。

2.4INT-767降低ApoE-/-小鼠巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥水平INT-767治療可降低循環(huán)細(xì)胞因子，如IL-1β，IL-6，IL-8和IL-12水平(表1) ;顯著降低ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部CD68陽(yáng)性(圖6)和單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞水平。此外，INT-767能顯著降低主動(dòng)脈炎癥標(biāo)記物，如IL-1β，IL-6、TNFα及MCP-1的表達(dá)。同時(shí)，ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈NF-κB的活性在進(jìn)行INT-767喂養(yǎng)后顯著降低(圖7)。

表1　INT-767對(duì)ApoE-/-小鼠炎癥因子水平的影響(±s，ng/ml)

表1　INT-767對(duì)ApoE-/-小鼠炎癥因子水平的影響(±s，ng/ml)

組別　IL-1β　 IL-6　IL-8　IL-12 Vehicle　5．2　 168．4　152．3　756．3 INT-767(30 mg/kg)　 2．1　 119．7　68．4　138．5

圖1　INT-767飲食降低高脂飲食對(duì)ApoE-/-小鼠的肥胖和高脂血癥表現(xiàn)

圖2　INT-767飲食降低高脂飲食對(duì)LDLR-/-小鼠的肥胖和高脂血癥表現(xiàn)

圖3　INT-767下調(diào)APOE-/-小鼠肝CYP8B1/CYP7A1表達(dá)降低血清膽酸/去氧膽酸水平

圖4　LDLR-/-小鼠主動(dòng)脈縱向剖面(×10)

圖5　APOE-/-小鼠主動(dòng)脈縱向剖面(×10)

圖6　APOE-/-小鼠主動(dòng)脈根部CD68表達(dá)(×10)

2.5TGR5激活降低巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)水平J774.2細(xì)胞是唯一高表達(dá)TGR5的細(xì)胞，其他巨噬細(xì)胞TGR5在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中于靜息期大量表達(dá)，但并不是在所有巨噬細(xì)胞中均表達(dá)，通過分析單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞系，包括Raw294.7，THP-1和U937細(xì)胞的TGR5水平均較低。INT-767也可以逆轉(zhuǎn)LPS對(duì)J774.2細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子(TNFα和IL-1β)的促進(jìn)作用，而PKA抑制劑Rp-8-Br-cAMPS (PKAI)又能逆轉(zhuǎn)INT-767對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)的抑制作用。EMSA分析顯示INT-767喂食能顯著降低細(xì)胞核中活化的NF-κB p50/p65復(fù)合物水平(圖8)，但并不影響LPS誘導(dǎo)TGR5/FXR低表達(dá)細(xì)胞系Raw294.7細(xì)胞因子的表達(dá)(表2)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TGR5或FXR后，Raw294.7細(xì)胞顯示出INT-767作用下細(xì)胞因子表達(dá)量降低的作用〔TGF50 mRNA相對(duì)表達(dá)水平: TGR5－為0，TGR5+為0.65; FXR mRNA相對(duì)表達(dá)水平: FXR－為0，F(xiàn)XR+為0.52〕。LPS處理高表達(dá)TGR5的Raw294.7細(xì)胞TNFα表達(dá)量較對(duì)照組降低，而不影響高表達(dá)FXR的Raw294.7細(xì)胞。

表2　INT767激活TGR5降低細(xì)胞因子相對(duì)表達(dá)水平

圖7　INT-767降低ApoE-/-小鼠巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥水平

圖8　INT-767激活TGR5降低NF-κB活化水平

3　討論

血脂異常與慢性炎癥是動(dòng)脈粥樣硬化的主要誘因，因此，找到能同時(shí)抑制血脂異常和炎癥反應(yīng)，從而降低動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)的化合物是具有重要臨床價(jià)值的〔8〕。一些報(bào)道表明，膽汁酸信號(hào)通路激活可防止或減輕血脂異常和炎癥反應(yīng)，主要是通過膽汁酸受體TGR5和FXR〔9，10〕。

本研究證明了一個(gè)新的FXR和TGR5雙重激動(dòng)劑，INT-767能有效地抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成，預(yù)防高脂血癥，并抑制巨噬細(xì)胞中促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌過程。INT-767除了能降低血清TC和TG水平，還能降低血清膽酸及其代謝產(chǎn)物(去氧膽酸，?；悄懰岷团；敲撗跄懰岷团；蛆Z去氧膽酸)水平，可能主要是通過激活FXR受體通路，從而減少肝膽酸合成酶CYP8B1的表達(dá)。

TGR5在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中于靜息期大量表達(dá)，但并不是在所有巨噬細(xì)胞中均表達(dá)，檢測(cè)不同細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，J774.2細(xì)胞是唯一高表達(dá)TGR5的細(xì)胞，其他巨噬細(xì)胞細(xì)胞的TGR5水平則均較低。INT-767可以逆轉(zhuǎn)LPS對(duì)J774.2細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子(TNFa和IL-1β)的促進(jìn)作用，膽汁酸可以作為信號(hào)分子與一些細(xì)胞受體結(jié)合，如FXR和GPCR TGR5受體。

膽汁酸在腸道被吸收后分布到全身，因此采用飲食中添加的方法制作模型是可行的〔10〕。激活外圍器官的TGR5和FXR有助于宿主的新陳代謝〔11〕。

NF-κB是調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)的重要途徑〔12〕，INT-767治療會(huì)顯著降低NF-κB的活化水平，因此在抑制炎癥和同時(shí)，還可以抗動(dòng)脈粥狀硬化斑塊的形成。

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〔2015-01-20修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者:鮑紅光(1964-)，男，主任醫(yī)師，主要從事心胸外科研究。

〔中圖分類號(hào)〕R541.4

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015) 16-4488-04;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.030