基于酶促反應動力學的無標準品ELISA抗體滴度定量方法＊

方 成，陳 卓，劉 立，梅志強

（武漢輕工大學：1.醫學院移植工程實驗室；2.生物與制藥工程學院，湖北武漢430023）

酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是將抗體、抗原的特異性反應與酶對底物的催化效應相結合的一種高特異性和高敏感性的實驗技術［1］。在臨床診斷、醫學研究、食品安全、植物資源、環境監測及生態學等領域廣泛應用［2］。ELISA 定量檢測試劑盒一般配備已知濃度標準品，通過建立標準曲線進行定量分析［3-4］。可是無標準品半定量檢測是探索性研究常使用的方法，許多研究工作處于無標準品，或只比較樣品差異度而無需標準品的狀態。如果僅以吸光度（absorbance，A）值的差異代表濃度（concenration，C）差異是有缺陷的，因為二者并非線性關系［5-6］。A值來自于某時點（即終點法），使用其定量C值的標準曲線呈S型，符合四參數函數，須使用標準品才能建立［5-6］。動力學定量方法則基于酶促反應最大速度與酶濃度成正比的原理［7-9］，通過測量反應初期底物濃度飽和時A值的變化速度來檢測樣品的濃度［10-11］。其標準曲線呈直線，在ELISA 定量檢測中具有更高的穩定性與準確性，目前其應用較少［6］。本研究以血清抗體檢測為例，建立無標準品的動力學ELISA 抗體滴度定量方法。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性封閉群昆明小鼠6 只，8～9 周齡，體質量35～40g，由湖北省實驗動物中心提供（許可證號SCXK 鄂2008-0005）。辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗小鼠IgG抗體購自Santa Cruze公司，底物四甲基聯苯胺（TMB）購自碧云天公司，iMARK 酶標儀購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法及分組設計 在96孔酶標板上設置非特異抗體、陰性對照、特異抗體和總抗體4組檢測孔。……