多巴胺對C8膠質細胞生長及LMO3和CIB1表達的影響

惠 玲，王曉輝，王美亮，楊霄鵬，馬明仁，桑春艷，李君紅，張富婷

星形膠質細胞在帕金森病(parkinsin＇s disease，PD)［1-2］的發生、發展中發揮著重要作用，依其不同的活性狀態可起神經保護或損傷作用，但其確切的作用機制還不十分清楚。現已明確膠質細胞表達D1、D2、D3、D5 受體［3］，具有類似神經元的攝取系統，是多巴胺作用的重要靶細胞。目前針對PD治療主要是增加腦內多巴胺神經遞質含量，促進改善腦內神經元功能，但多巴胺對腦內膠質細胞影響目前并未進行深入研究。早期研究發現，紋狀體內直接注射多巴胺可導致神經元凋亡、神經退變，而星形膠質細胞則發生活化和增生［4］。膠質細胞在腦內數量巨大并參與腦內多種功能［5］，闡明多巴胺對膠質細胞功能的影響，對相關疾病治療具有重要作用。同時多巴胺作為細胞外信號作用于星形膠質細胞，必然引起細胞內系列級聯反應，包括不同環節的基因表達［6］。LMO3是多巴胺刺激膠質細胞上調表達基因之一，腦內特異表達，在神經系統發育、分化及腫瘤發生中起重要作用［7-9］;CIB1是有EF手型結構的細胞內鈣結合蛋白，在組織細胞中廣泛表達，可與LMO3在內的多種蛋白結合，以細胞特異方式在神經發育、神經退行性疾病、細胞分裂和分化、腫瘤發生等過程中發揮重要作用［10-12］。為此，我們檢測不同濃度多巴胺處理對C8膠質細胞功能影響;檢測不同多巴胺拮抗劑及激動劑處理對C8膠質細胞功能的影響，以探究在此過程中起作用的多巴胺受體;同時檢測多巴胺處理對C8膠質細胞內源性LMO3及CIB1表達定位影響，為進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 多巴胺D1受體激動劑SKF-38393、D2受體激動劑quinpirole(MW:292.3)、D1受體拮抗劑SCH-23390(MW:324.24)、D2受體拮抗劑Spiperone(MW:395.5)(以上均購自美國Sigma公司);膠質細胞株C8-D1A購自美國ATCC公司;DMEM培養基購自Gibco公司，新生牛血清購自杭州四季青公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗液的制備:稱取多巴胺D1受體激動劑0.291 mg、D2受體激動劑0.292 mg、D1受體拮抗劑0.324 mg、D2受體拮抗劑0.395 mg，分別用10 ml PBS溶解，0.2μmol/L濾器過濾，制成100μmol/L的儲存液。實驗時取儲存液0.5μl，用PBS稀釋為0.05μmol/L的工作液。

1.2.2 不同濃度多巴胺對C8膠質細胞增殖的影響:取對數生長期C8膠質細胞消化傳代并接種于96孔培養板中，每孔接種1.5×104個細胞并加入100μl含10%小牛血清的DMEM中，四周孔加空白DMEM，培養過夜。根據加入多巴胺濃度的不同分為10μmol/L、100 μmol/L、500 μmol/L多巴胺組及空白對照組，每組設5個重復孔，分別培養24、48、72和96 h，培養結束后吸出原有培養液，用D-Hank液洗2次，每孔加入含10%MTT(溶解在5 mg/ml、pH 7.4、PBS 0.01μmol/L 中，過濾除菌，于密閉棕色瓶中4℃保存)無血清培養液100μl，37℃繼續孵育4 h終止培養，小心吸棄孔內培養上清液(盡量吸凈培養樣孔內殘余培養液)。每孔加150μl DMSO，振蕩10 min，570 nm波長測定各孔吸光度(OD570)，重復3次。

1.2.3 多巴胺受體激動劑及拮抗劑對C8膠質細胞生長的影響:取對數生長期C8膠質細胞消化傳代接種于96孔培養板中，每孔0.5×104個細胞，培養過夜，棄原有培養基，換分別含有200μmol/L上述各種多巴胺受體激動劑或拮抗劑的培養基，30 min后除對照組外各組分別加入多巴胺，設為空白對照組(未予任何處理)、多巴胺組(予100μmol/L多巴胺，含 0.001%的抗壞血酸)、D1組(予200μmol/L多巴胺 D1受體激動劑)、D2組(予200μmol/L多巴胺 D2受體激動劑)、aD1組(予200μmol/L多巴胺 D1受體拮抗劑)、aD2組(予200μmol/L多巴胺D2受體拮抗劑)，每組設5個重復孔。培養24 h后吸出原有培養液，MTT法檢測各孔吸光度。

1.2.4 不同濃度多巴胺對C8膠質細胞LMO3及CIB1表達定位的影響:六孔板每孔放入蓋玻片，接種約2×105個對數生長期C8膠質細胞，培養過夜，次日棄原有培養基，分別加入新配的含10、100、500μmol/L多巴胺培養液，對照組不放入多巴胺培養液，培養24 h。24 h后取出蓋玻片，PBS溶液清洗3次，4%多聚甲醛固定細胞。免疫熒光染色:固定的蓋玻片用0.01mol/L PBS漂洗3次，每次5 min，1%BSA/0.4%Triton37℃孵育30 min，抗LMO3抗體(1︰50)37℃ 2 h，4℃過夜。PBS漂洗3次，羊抗兔Tritc(1︰50)37℃ 3 h，PBS漂洗3次，每次5 min。1%BSA/0.4%Triton37℃孵育30 min，抗CIB1抗體(1︰50)37℃ 2 h，4℃過夜，PBS漂洗3次，羊抗小鼠FITC(1︰50)37℃3 h，PBS漂洗3次，甘油封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 Hoechst染色檢測不同濃度多巴胺對C8膠質細胞核的作用:接種約2×105個對數生長期C8膠質細胞于六孔板蓋玻片上，培養過夜，次日棄原有培養基，分別加入新配的含10、100、500μmol/L多巴胺培養液，對照組不加多巴胺培養液，培養24 h后取出蓋玻片，用PBS溶液清洗3次，4%多聚甲醛固定細胞，各組細胞爬片后用PBS液浸洗3 min，甩去PBS，滴加200μl Hoechst 33258染液，室溫下染色10 min，PBS振洗，3 min×3次。加抗淬滅液封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統計學方法 應用SPSS 13.0軟件處理實驗數據。實驗數據以均數±標準差(x±s)表示，采用單因素方差分析。以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 不同濃度多巴胺對C8膠質細胞增殖的影響不同濃度多巴胺(10、100、500 μmol/L)處理 C8膠質細胞后，經單因素方差分析，多巴胺作用C8膠質細胞48～96 h，100μmol/L組細胞與空白對照組相比顯著增加(48 h時，P＜0.01，72 h及96 h時，P＜0.05);48 h～72 h時，100μmol/L組比10μmol/L組細胞顯著增加(48 h時，P＜0.01，72 h時，P＜0.05);而高濃度組(500μmol/L)細胞與其他各組比較，細胞生長明顯被抑制(P＜0.05);因此多巴胺對C8膠質細胞的作用與濃度明顯相關，本實驗低濃度(10μmol/L)對C8膠質細胞無明顯影響，中濃度組(100μmol/L)可明顯促進C8膠質細胞的增殖，而高濃度組(500μmol/L)則抑制C8膠質細胞生長。見表1及圖1。

表1 不同濃度多巴胺對C8膠質細胞增殖的影響(x±s，OD570值)

圖1 不同濃度多巴胺對C8膠質細胞增殖的影響

2.2 多巴胺受體激動劑、拮抗劑對C8膠質細胞生長的影響 C8膠質細胞用100μmol/L多巴胺及200μmol/L各種不同多巴胺受體激動劑或拮抗劑處理24 h后，測定OD570值:空白對照組0.0416±0.012;多巴胺組0.0630±0.021;D1組0.0386±0.011;D2組0.0788±0.016;aD1組0.0622±0.009;aD2組0.0936±0.016。經單因素方差分析可見，除D1組外，其余各組OD570值均大于空白對照組(P＜0.05或P＜0.01);多巴胺組OD570值高于D1組，低于aD2組，差異均有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01);除空白對照組外，D1組OD570值均明顯少于其他各組(P＜0.05或P＜0.01)。見圖2。提示多巴胺作用于C8膠質細胞主要通過D2受體作用，多巴胺通過D2受體刺激C8膠質細胞增殖，而多巴胺D2受體拮抗劑Spiperone對多巴胺刺激引起的C8膠質細胞增殖有協同作用。

2.3 不同濃度多巴胺處理對C8膠質細胞中LMO3及CIB1定位的影響 通過對比免疫熒光圖像可以看出，空白對照組C8膠質細胞中的LMO3及CIB1在胞核及胞漿中均有表達，但以胞核表達為主，核內呈現高亮度的熒光圖像，高濃度500μmol/L時C8膠質細胞出現了明顯的形態學變化，熒光顯微鏡下可見核內出現大量空泡，染色質呈斑塊狀。隨著加入多巴胺濃度的升高，CIB1在核內的亮度下降，胞漿中的表達增加，而LMO3無明顯變化。見圖3。半定量結果顯示，與空白對照組比較，低濃度組(10μmol/L多巴胺)處理后顯著增加LMO3蛋白表達水平(P＜0.05);與空白對照組相比，高濃度組(500μmol/L多巴胺)降低了CIB1蛋白表達水平 (P＜0.05)。見表3。

表3 不同濃度多巴胺處理對C8膠質細胞中LMO3及CIB1細胞平均熒光強度影響(x±s)

圖3 熒光顯微鏡觀察不同濃度多巴胺處理對C8膠質細胞中LMO3及CIB1表達及定位的影響(Hoechst染色×400)

2.4 Hoechst染色檢測不同濃度多巴胺對C8膠質細胞核的作用 因為Hochest33258只與DNA結合，故RNA及胞漿均不著色，從而便于觀察以核改變為主的凋亡細胞。在紫外光激發下，通過熒光顯微鏡觀察到空白對照組、10μmol/L組及100μmol/L組細胞核大多呈大小一致的圓形，染色均勻，為正常細胞核形態，罕見凋亡細胞，可見較多處于分裂終末期濃縮核，而500μmol/L組C8膠質細胞可見逐漸增多的凋亡細胞核改變，核體積縮小，呈大小不一不規則狀，染色不均勻，呈顆粒、塊狀濃染、染色質濃集、斷裂成塊、胞核呈現較強的亮藍色熒光。見圖4。

圖4 熒光顯微鏡觀察不同濃度多巴胺對C8膠質細胞核形態的改變(Hoechst染色×400)A.空白對照組;B.10μmol/L組;C.100μmol/L組;D.500μmol/L組

3 討論

已有研究證實，星形膠質細胞可以合成和釋放神經遞質、神經營養因子，這些細胞通過向微環境中釋放生長因子而滿足神經元的生長需求［6，13-15］。不同種屬及大腦不同部位的星形膠質細胞均能被多巴胺激活。我們研究發現，低濃度多巴胺(10μmol/L)對C8膠質細胞的生長無明顯影響，中濃度多巴胺(100μmol/L)可顯著促進C8膠質細胞的增殖，而高濃度多巴胺(500μmol/L)則起相反作用，抑制了C8膠質細胞生長。進一步研究發現，多巴胺D2受體激動劑qμinpirole能顯著促進C8膠質細胞生長，而多巴胺D1受體激動劑SCH-23390則對C8膠質細胞的生長無影響，表明多巴胺對C8膠質細胞的作用可以通過激活D2受體引起細胞功能的變化。

Khan等［16］研究表明，10～500 μmol/L 多巴胺可以促進轉染了多巴胺D2受體的C6細胞(C6-D2L)DNA的合成并促進細胞有絲分裂，而這種作用是通過激活多巴胺D2受體實現的;同時他們的研究還發現，200μmol/L多巴胺可以促進C6-D2L中GFAP的表達，而500μmol/L多巴胺處理組的GFAP表達卻明顯降低。Hattori等［4］在人體實驗中用不同濃度多巴胺注射大鼠的紋狀體部位，發現凋亡細胞的比例與濃度成正比。袁崇剛和薛小琳［17］在離體實驗中同樣觀察到高濃度多巴胺(400μmol/L)導致PC12細胞存活率大幅度降低，流式細胞儀觀測到凋亡峰，而低濃度多巴胺對細胞存活率無明顯影響，說明多巴胺細胞毒性存在濃度相關性。因此提示多巴胺對C8膠質細胞作用有濃度相關性，高濃度多巴胺抑制增殖，促進細胞凋亡，可能與多巴胺神經毒性作用有關。

多巴胺通過受體發揮作用，多巴胺受體屬于G蛋白偶聯受體(GPCR)，根據其藥理學特征和信號轉導通路的不同分為D1類和D2類多巴胺受體。D1類受體包括D1、D5兩種亞型，D2類受體包括D2、D3、D4三種亞型。現已明確膠質細胞表達D1、D2、D3、D5受體，具有類似神經元的多巴胺攝取系統，是多巴胺作用的重要靶細胞，在腦部疾病的發生中具有重要作用［5］。我們研究發現，多巴胺可以通過D2受體促進細胞增殖，但D2受體拮抗劑spiperone不但不能拮抗多巴胺所引起的C8膠質細胞增殖作用，而且具有協同多巴胺促生長作用，這種現象可能與多巴胺受體超敏性(多巴胺受體拮抗劑誘導受體數目增加)有關。多巴胺受體超敏是多巴胺受體對拮抗劑的反應(包括行為、電生理、靶器官反應)增強現象，它是機體的一種代償性機制，具有以下特征:受體數目增多、密度升高、D1和D2受體的脫耦聯、親和力增加等［18］。在6-羥基多巴胺單側損毀的大鼠PD模型上發現，刺激D1或D2受體均能激活磷酸化ERK，而抑制ERK活性后可顯著降低D2受體介導的PD大鼠旋轉運動，說明ERK在多巴胺受體超敏性的形成中發揮著關鍵作用［19-20］。痕量胺關聯受體1(TAAR1)缺失鼠的紋狀體中多巴胺D2受體超表達，而與多巴胺D2受體相關的AKT/GSK3信號通路選擇性激活，表明TAAR1與D2受體的超敏功能相關［21］。多巴胺系統參與調節精神和情緒，而多巴胺系統功能異常將導致精神疾病，例如在精神分裂癥中，D2受體功能亢進［17-18］，因此臨床上使用D2受體拮抗劑作為抗精神病藥，但常因多巴胺受體超敏而影響其療效并引起一些嚴重不良反應。目前關于膠質細胞與多巴胺受體超敏的研究尚未見報道，由于膠質細胞具有多種多巴胺受體，腦中多巴胺濃度的變化及在抗精神分裂癥過程中的多巴胺受體藥物治療對膠質細胞功能也會產生影響，這種對疾病治療的影響需要引起我們今后的關注。

多巴胺作為細胞外信號作用于星形膠質細胞，必然引起細胞內系列的級聯反應，包括不同環節的基因表達。LMO3是多巴胺刺激膠質細胞上調表達的基因之一，本研究發現，在低濃度多巴胺(10μmol/L)作用下，LMO3表達量增加，與我們前期的研究結果一致［22］;LMO3在細胞內的表達以胞核為主，細胞質中也有少量表達。CIB1在高濃度多巴胺(500μmol/L)刺激下，表達量與對照組相比顯著減少。而我們已有的研究發現共轉染LMO3及CIB1的C8膠質細胞中，兩種蛋白在細胞質中共定位，CIB1抑制 LMO3引起的 C8膠質細胞增殖［23］，說明CIB1過表達引起細胞抑制與高濃度多巴胺引起C8膠質細胞生長抑制可能是不同信號通路，對此尚需進一步深入研究。

［1］ 于寶成，徐若華，何建政，等.軍隊男性高齡離退休干部帕金森病患病情況及相關因素調查分析［J］.解放軍醫藥雜志，2013，25(8):69-72.

［2］ 韓煒，張小青，郭艷丹，等.帕金森病的防治與護理進展［J］.解放軍預防醫學雜志，2015，33(1):100-102.

［3］ Miyazaki I，Asanuma M，Diaz-Corrales F J，et al.Direct evidence for expression of dopamine receptors in astrocytes from basal ganglia［J］.Brain research，2004，1029(1):120-123.

［4］ Hattori A，Luo Y，Umegaki H，et al.Intrastriatal injection of dopamine results in DNA damage and apoptosis in rats［J］.Neuroreport，1998，9(11):2569-1572.

［5］ Shao W，Zhang SZ，Tang M，et al.Suppression of neuroinflammation by astrocytic dopamine D2 receptors via alphaB-crystallin［J］.Nature，2013，494(7435):90-94.

［6］ Beardsley P M，Hauser K F.Glial modulators as potential treatments of psychostimulant abuse［J］.Advances in pharmacology，2014，69:1-69.

［7］ Savarese A，Zou M E，Kharazia V，et al.Increased behavioral responses to ethanol in Lmo3 knockout mice［J］.Genes Brain Behav，2014.13(8):777-783.

［8］ Watanabe H，Francis J M，Woo M S，et al.Integrated cistromic and expression analysis of amplified NKX2-1 in lung adenocarcinoma identifies LMO3 as a functional transcriptional target［J］.Genes Dev，2013，27(2):197-210.

［9］ Isogai E，Ohira M，Ozaki T，et al.Oncogenic LMO3 collaborates with HEN2 to enhance neuroblastoma cell growth through transactivation of Mash1［J］.PLoS One，2011，6(5):19297.

［10］ Sun W，Guan Q，Wen J，et al.Calcium-and integrinbinding protein-1 is down-regulated in the sperm of patients with oligoasthenozoospermia:CIB1 expression in patients with oligoasthenozoospermia［J］.J Assist Reprod Genet，2014，31(5):541-547.

［11］ Leisner T M，Moran C，Holly SP，et al.CIB1 prevents nuclear GAPDH accumulation and non-apoptotic tumor cell death via AKT and ERK signaling［J］.Oncogene，2013，32(34):4017-4027.

［12］ Chan JP，Sieburth D.Localized sphingolipid signaling at presynaptic terminals is regulated by calcium influx and promotes recruitment of priming factors［J］.J Neurosci，2012，32(49):17909-17920.

［13］張峪涵，楊磊，黃瑾神.經營養因子用于治療中樞神經系統疾病［J］.中國綜合臨床，2005，21(3):283-285.

［14］屈趙，張麗，李林，等.不同劑量 MOG35-55對 EAE小鼠 p-JAK1、BDNF表達的影響［J］.中國首都醫科大學學報，2014，35(6):725-729.

［15］呂彥，何凡，曲方，等.海灣戰爭綜合征模型大鼠海馬腦源性神經營養因子及其受體和調節因子的表達［J］.解放軍預防醫學雜志，2013，31(6):490-492.

［16］ Khan Z U，Koulen P，Rubinstein M，et al.An astroglialinked dopamine D2-receptor action in prefrontal cortex［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98(4):1964-1949.

［17］袁崇剛，薛小琳.多巴胺對PC12細胞的雙重影響［J］.實驗生物學報，2002，35(2):98-102.

［18］Seeman P，Weinshenker D，Quirion R，et al.Dopamine supersensitivity correlates with D2High states，implying many paths to psychosis.Proceedings of the National A-cademy of Sciences of the United States of America［J］.See comment in PubMed Commons belowProc Natl Acad Sci U SA，2005，102(9):3513-3518.

［19］ Zhen X，Torres C，Cai G，et al.Inhibition of protein tyrosine/mitogen-activated protein kinase phosphatase activity is associated with D2 dopamine receptor supersensitivity in a rat model of Parkinson＇s disease［J］.Molecular pharmacology，2002，62(6):1356-1363.

［20］Gerfen C R，Miyachi S，Paletzki R，et al.D1 dopamine receptor supersensitivity in the dopamine-depleted striatum results from a switch in the regulation of ERK1/2/MAPkinase［J］.See comment in PubMed Commons belowJ Neurosci，2002，22(12):5042-5054.

［21］Espinoza S，Ghisi V，Emanuele M，et al.Postsynaptic D2 dopamine receptor supersensitivity in the striatum of mice lacking TAAR1［J］.Neuropharmacology，2015，93:308-313.

［22］Shi J，Cai W，Chen X，et al.Identification of dopamine responsive mRNAs in glial cells by suppression subtractive hybridization［J］.Brain research，2001，910(1-2):29-37.

［23］ Hui L，Ji C，Hui B，et al.The oncoprotein LMO3 interacts with calcium-and integrin-binding protein CIB1［J］.Brain research.2009，1265:24-29.