DPPC抑制A549細胞增殖、阻滯細胞周期及誘導DNA損傷的初步探究

桑春艷，楊霄鵬，張富婷，李君紅，惠 玲

在全世界范圍內，肺癌是引起人類死亡的主要癌癥類型之一，平均每年有100多萬人死于肺癌，有140多萬人確診為肺癌，而非小細胞肺癌占所有肺癌的80% ～85%［1］。植物提取物及其衍生物具有較好的生物活性。鬼臼毒素是從鬼臼屬植物中提取的木脂素類化合物，具有潛在的抗腫瘤活性，其衍生物依托泊苷(VP16)和替尼泊苷(VM26)目前已應用于臨床［2］，但是近年來臨床用藥過程中發現，二者均存在耐藥性、水溶性差的問題，同時也有嚴重的骨髓抑制以及口服效果差等缺點。因此，尋找高效低毒的鬼臼毒素衍生物成為高效化療藥物開發的熱點［3］。本文研究鬼臼毒素衍生物(DPPC)體外對非小細胞肺癌A549細胞的增殖抑制作用，以及對細胞周期相關調控蛋白表達的影響，探討DPPC抑制腫瘤細胞增殖的可能機制，為臨床抗腫瘤藥物研發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 DPPC由蘭州大學藥學院提供，純度達95%以上，用二甲基亞砜(DMSO)配置使DPPC初始濃度達0.01 mol/L，-20℃儲存。VP16(湖北鑫源順醫藥化工有限公司，批號:33419-42-0)。A549細胞購于中科院上海細胞庫，RPMI1640、DMSO、噻唑藍(MTT)購自美國Sigma公司，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司。倒置顯微鏡購自日本Olympus公司;電泳儀、轉膜儀、高速冷凍離心機、酶標儀、PCR儀、Western blot曝光儀均購自Bio-Rad公司;INC153型CO2培養箱購自德國美墨爾科技公司;流式細胞儀購自美國BD公司;細胞超凈工作臺購自新加坡ESCO公司。VP16和DPPC分子構成見圖1。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組:以DPPC處理后的A549細胞為DPPC組，以VP16處理后的A549細胞為陽性對照組，未經任何藥物處理的A549細胞為陰性對照組。

1.2.2 細胞培養:取人非小細胞肺癌A549細胞用RPMI-1640完全培養基(10%新生牛血清，100 U/ml青霉素和鏈霉素)在37℃、5%CO2條件下培養至70% ～80%，在對數生長期進行傳代培養，細胞密度為2 ×106/ml。

1.2.3 MTT實驗:接種培養后的A549細胞于96孔板上，每孔細胞數量為 6×103～1×104個。37℃、5%CO2條件下培養過夜，細胞貼壁生長后向培養基中分別加入 0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L的DPPC和VP16，各藥物每個濃度設6個復孔。陰性對照組不加任何藥物。培養48 h(或0.1μmol/L給藥分別培養 12、24、48、60、72 h)，棄培養液，加入5 mg/ml的 MTT溶液，37℃、5%CO2條件下孵育4 h，離心，棄上清液，加入 100 μl的 DMSO，震蕩10 min，混勻，置于全波長多功能酶標儀在490 nm波長處測定每孔吸光度(OD值)，計算抑制率IR(%)，IR(%)=(1-ODVP16組/DPPC組/OD陰性對照組)×100%，實驗重復3次。

1.2.4 細胞形態學觀察:取 A549細胞加入0.5μmol/L DPPC、VP16和未加入任何藥物處理24 h后，在倒置顯微鏡(40×)下觀察細胞的生長形態。

1.2.5 細胞流式實驗:取對數生長期A549細胞貼壁生長后，分別用0.1、0.2、0.5μmol/L的DPPC處理。用不加任何藥物處理的細胞做陰性對照。分別取以上不同濃度DPPC處理后的細胞消化、離心，收集細胞，棄培養液，加入1 ml碘化丙啶(PI)染色液，避光染色15 min，流式細胞儀上機檢測。

1.2.6 蛋白免疫印跡(Western blot)實驗:取對數生長期A549細胞，傳代貼壁生長后用0.1、1μmol/L的DPPC處理，用不加任何藥物處理的細胞做陰性對照。24 h后，棄培養液，加入裂解液低溫提取細胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度，蛋白提取液加入上樣緩沖液變性，以相同的總蛋白量上樣，加入5%濃縮膠、10%分離膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉膜，封閉，加入1︰1000一抗，4℃過夜，TPS洗滌，加入1︰10 000二抗，室溫下孵育2 h，洗滌，加ECL顯色液，曝光儀曝光，分析數據，實驗重復3次。檢測周期調控蛋白cyclinB1、cdc2(p34)和p-cdc2以及DNA損傷因子 γ-H2AX的表達。

1.3 統計學方法 應用SPSS 13.0軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差(x±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 DPPC對A549細胞增殖的影響 MTT實驗顯示，DPPC、VP16不同濃度(0.001～10 μmol/L)處理A549細胞48 h后或不同時間(12～72 h)同一濃度(0.1μmol/L)處理A549細胞后，DPPC較VP16能夠更明顯地抑制腫瘤細胞的增殖，并呈時間和劑量依賴性。見圖2和表1、2。

圖2 DPPC和VP16對A549細胞的增殖抑制作用DPPC為鬼臼毒素衍生物，VP16為依托泊苷

表1 不同濃度DPPC和VP16處理A549細胞48 h后的細胞抑制率(x ± s，%)

表2 0．1μmol/L的DPPC和VP16不同處理時間對A549細胞的抑制率(x ± s，%)

2.2 DPPC對A549細胞形態的影響 倒置顯微鏡下可見陰性對照組A549細胞排列緊密、貼壁生長旺盛，細胞多為不規則多邊形，細胞胞質透明，細胞膜邊緣清晰(圖3A)。VP16組細胞較陰性組細胞有輕微的狀態改變，細胞貼附能力減弱，部分細胞膨脹，體積變大(圖3B)。與陰性對照組和VP16組比較，DPPC組細胞呈現整體萎縮，細胞變圓，皺縮，并出現細胞碎片，細胞膜邊緣出現小氣泡等形態改變(圖3C箭頭所示)。

圖3 DPPC和VP16對A549細胞形態的影響(×40)A.未加入任何藥物處理24 h后的A549細胞;B.加入VP16 0.5μmol/L處理24 h后的A549細胞;C.加入DPPC 0.5μmol/L處理24 h后的A549細胞。DPPC為鬼臼毒素衍生物，VP16為依托泊苷

2.3 DPPC對A549細胞周期的影響 細胞流式實驗顯示，陰性對照組G2/M期細胞占11.0%，隨著DPPC濃度的增加，A549細胞周期大多阻滯在G2/M期，當DPPC濃度為0.5μmol/L時，G2/M期細胞阻滯率達93.7%(圖4)。提示DPPC良好的抗細胞增殖作用可能與其對細胞周期的影響有關。

圖4 不同濃度DPPC處理的A549細胞流式圖(A)以及柱狀圖(B)分析DPPC為鬼臼毒素衍生物

2.4 DPPC對細胞周期相關調節蛋白表達的影響Western blot 實驗表明，0.1、1 μmol/L DPPC 處理A549細胞24 h后，cyclinB1和cdc2(p34)蛋白條帶灰度明顯加深，而p-cdc2蛋白的灰度隨給藥濃度的增加而減少。cyclinB1和cdc2(p34)的表達隨著給藥濃度的增加而增加，同時p-cdc2蛋白的表達減少(圖5和表3)。提示DPPC能夠影響A549細胞周期關鍵調控蛋白的表達，從而阻滯細胞周期，抑制細胞增殖。

圖5 蛋白印跡實驗檢測DPPC對A549細胞周期相關調節蛋白的表達DPPC為鬼臼毒素衍生物

表3 不同濃度DPPC對A549細胞周期相關調節蛋白表達的影響(x ± s，%)

2.5 DPPC對A549細胞DNA損傷因子表達的影響 Western blot實驗結果顯示，和陰性對照組比較，1μmol/L DPPC組的組蛋白H2AX磷酸化形成的γ-H2AX明顯增加(圖6);陰性對照組 γ-H2AX灰度值為(26.23±10.51)%，1μmol/L DPPC組γ-H2AX灰度值為(98.51±15.20)%，比較差異有統計學意義(P＜0.01)。因A549細胞受到輻射或其他外界誘因后，其DNA雙鏈結構發生斷裂，斷裂點附近的組蛋白H2AX會發生磷酸化的應激反應。提示DPPC能夠引起細胞DNA雙鏈的斷裂損傷，從而引起組蛋白應激變化，啟動下一級聯反應，對細胞的增殖產生抑制作用。

圖6 蛋白印跡實驗檢測DPPC對A549細胞DNA損傷因子γ-H2AX表達的影響DPPC為鬼臼毒素衍生物，與陰性對照組比較，b P＜0.01

3 討論

近年來，惡性腫瘤嚴重威脅著人類的健康，全球每年約有690萬人死于惡性腫瘤，約有800多萬的腫瘤新發病例，且數字呈逐年增漲趨勢［4］。惡性腫瘤具有發病率高、治愈率低、致死率高等特點，對人類的生命健康構成嚴重威脅。

鬼臼毒素及其衍生物的抗腫瘤作用顯著，為尋找毒性小、療效高的抗腫瘤藥物，國內外合成了大量具有抗腫瘤活性的鬼臼毒素衍生物［5］。鬼臼毒素及其衍生物通過抑制細胞微管蛋白聚合，使細胞分裂停止在中期，阻止有絲分裂，使細胞周期發生紊亂，從而抑制腫瘤細胞的增殖［6］。同時，化療藥物通過引起腫瘤細胞DNA損傷而抑制細胞增殖的機制也越來越受到人們的關注。因此，為了得到更加高效低毒的鬼臼毒素衍生物，本研究通過初步體外活性篩選發現，DPPC對A549細胞的抑制作用與VP16比較效果更加明顯，表明DPPC對非小細胞肺癌細胞的抑制作用明顯強于目前用于臨床非小細胞肺癌化療的VP16，且抑制腫瘤生長呈濃度和時間依賴性，細胞形態學研究也能夠說明DPPC對A549細胞顯著的增殖抑制作用。同時，DPPC能夠阻滯A549細胞周期停滯在G2/M期，使周期調節蛋白cyclinB1和cdc2(p34)的表達量增加，而抑制p-cdc2的表達。G2/M期是細胞有絲分裂開始的時期，cyclinB1和cdc2(p34)蛋白是細胞周期檢查點的重要調控蛋白，cyclinB1的過表達以及cdc2(p34)磷酸化的減少都可能影響到細胞的正常增殖［7-11］。正常細胞分裂從G2期到M期的過程中，主要依賴周期蛋白cyclinB1觸發的cdc2激酶介導的周期變化［8］，通過調節蛋白的磷酸化和去磷酸化，以及蛋白間的相互結合調控細胞的增殖或抑制生長［12-13］。因此我們研究DPPC對A549細胞cyclinB1、cdc-2(p34)以及磷酸化cdc2的表達，結果表明，DPPC對細胞周期具有明顯的調控作用，和細胞流式實驗結果相一致。

組蛋白H2AX在細胞中具有DNA重組、性染色體失活等功能［10］，最近研究發現，DNA損傷后核心組蛋白的化學修飾能引起染色質結構的改變，從而促進DNA的修復［14-16］。組蛋白的磷酸化、乙酰化、甲基化，在大量細胞核事件尤其是轉錄調控中發揮了廣泛作用［12-13］。此外，在細胞周期調控過程中，主要檢測DNA是否有損傷，以及通過檢測損傷是否被修復確定細胞能否繼續分裂增殖［14-18］。DPPC能夠使A549細胞的DNA雙鏈斷裂，使組蛋白H2AX磷酸化增加，γ-H2AX快速轉導DNA損傷信號，導致下游分子磷酸化的激活，引發一系列生物級聯反應和細胞學反應，使腫瘤細胞趨于死亡［19-22］。由此可見，DPPC能夠在損傷細胞DNA的同時調控細胞周期，通過對細胞增殖多方面的調節，抑制腫瘤細胞的生長，達到抑制腫瘤細胞發展的效果。DPPC作為具有潛在抗腫瘤作用的新型鬼臼毒素衍生物，其更多的抑制腫瘤作用機制以及體內成藥性還有待進一步的深入研究。

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