HPLC-ELSD法測定葛蘭心寧軟膠囊中絞股藍(lán)皂苷XL IL的含量

閻　博，吳　芳，劉海靜，，唐瑜蓉，喬蓉霞

(1．陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽　712046；2.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安　710061)

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HPLC-ELSD法測定葛蘭心寧軟膠囊中絞股藍(lán)皂苷XL IL的含量

閻博1，吳芳2，劉海靜1，2，唐瑜蓉1，喬蓉霞2

(1．陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽712046；2.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安710061)

摘要:目的建立以HPLC-ELSD法測定葛蘭心寧軟膠囊中絞股藍(lán)皂苷XL IX含量的方法。方法色譜柱為Kromasil C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈—水(35∶65)，檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器，流速2.8 L·min-1，漂移管溫度105℃。結(jié)果絞股藍(lán)皂苷XL IL的線性良好，Y(峰面積)=1.56X+5.25，r=0.999，平均回收率(n=6)為101.56%，絞股藍(lán)皂苷XL IX在0.513～10.254 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。。結(jié)論該方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性良好，可用于葛蘭心寧軟膠囊的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞:葛蘭心寧軟膠囊；HPLC；絞股藍(lán)皂苷XL IX；含量測定

葛蘭心寧軟膠囊處方由葛根總黃酮、山楂提取物和絞股藍(lán)總苷組成，有活血化瘀，通絡(luò)止痛的功效，用于瘀血閉阻所致的冠心病、心絞痛。絞股藍(lán)中主要含皂苷類成分，此外還含有黃酮類、氨基酸、糖、微量元素等成分。對機(jī)體代謝、應(yīng)激性反應(yīng)、抗癌作用、對神經(jīng)系統(tǒng)的影響、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。據(jù)文獻(xiàn)記載，絞股藍(lán)皂苷具有較好的抗癌作用并且能明顯提高小鼠空斑形成細(xì)胞和血凝抗體[1]；也有采用熒光光譜法研究絞股藍(lán)皂苷對人血清白蛋白(HSA)的猝滅作用[2]。葛蘭心寧軟膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未對絞股藍(lán)總苷進(jìn)行質(zhì)量控制。絞股藍(lán)總苷的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中薄層色譜鑒別項(xiàng)和含量測定項(xiàng)均以絞股藍(lán)皂苷-A為對照品，但絞股藍(lán)皂苷-A對照品不能從中國食品藥品檢定研究院和其他機(jī)構(gòu)獲得，故目前標(biāo)準(zhǔn)中未對絞股藍(lán)總苷進(jìn)行有效的控制。

葛蘭心寧軟膠囊是2012年國家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高行動(dòng)計(jì)劃品種，根據(jù)國家藥典委員會要求，我們對處方中絞股藍(lán)總苷的質(zhì)量控制方法進(jìn)行了研究。近年來我省食品藥品行業(yè)通過測定絞股藍(lán)皂苷XL IL的含量控制絞股藍(lán)總苷的質(zhì)量。我們使用購自西安鴻程生物科技有限公司的絞股藍(lán)皂苷XL IL對照品進(jìn)行了以下含量測定方法學(xué)試驗(yàn)，本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[3-4]，采用HPLC-ELSD法測定絞股藍(lán)皂苷XL IL的含量，以對絞股藍(lán)相關(guān)制品質(zhì)量控制提高參考依據(jù)。

1儀器、試劑及試藥

1.1儀器高效液相色譜儀(Waters HT系統(tǒng)、Waters Allance系統(tǒng))，Alltech 2000ES蒸發(fā)光散射檢測器，德國塞多利斯公司BP2110電子分析天平，BS224S電子分析天平。

1.2試劑乙腈(色譜純，TEDIA公司)、葛蘭心寧軟膠囊(批號分別為20120221、20120222、20120223、20120224、20120225、20120226、20120227、20120228、20120229、20120231)、高純水，其余試劑均為分析純。

1.3樣品絞股藍(lán)皂苷XL IX對照品購自西安鴻程生物科技有限公司，批號為20100718，HPLC純度為99.9%。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱(Kromasil 100-5C18250 mm×4.6 mm,E59030)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35℃；Alltech ELSD 2000ES蒸發(fā)光散射檢測器，流動(dòng)相為乙腈—水(35∶65)，流速2.8 L·min-1，漂移管溫度105℃；理論板數(shù)按絞股藍(lán)皂苷XL IL峰計(jì)應(yīng)不低于2 000。

2.2溶液的配制

2.2.1對照品溶液的制備稱取80 ℃減壓干燥3 h的絞股藍(lán)皂苷XL IX對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備取本品10粒內(nèi)容物(盡量取盡膠囊內(nèi)壁殘留)，將內(nèi)容物混勻，取約1.5 g，置錐形瓶中，加10%甲醇40 mL，水浴回流40 min，用少量棉花濾過，用10 mL水洗滌玻璃容器和棉花，濾液合并于分液漏斗中，用乙醚40 mL振搖提取，棄去乙醚液，水液用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次40 mL，合并正丁醇液，再分別用氨試液30 mL和正丁醇飽和的水30 mL洗滌，棄去洗滌液。正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状疾⒍ㄈ萦?0 mL容量瓶中，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.3測定法分別精密吸取對照品溶液10、20 μL，與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，以外標(biāo)兩點(diǎn)法對數(shù)方程計(jì)算，即得。

2.3專屬性試驗(yàn)按上述方法制備缺絞股藍(lán)總苷提取物的陰性溶液、對照品溶液、供試品溶液，分別進(jìn)入液相色譜儀，陰性樣品的色譜圖在與絞股藍(lán)皂苷XL IX對照品色譜峰相同保留時(shí)間處未見明顯色譜峰,見圖1。

2.4線性關(guān)系考察稱取絞股藍(lán)皂苷XL IX 12.83 mg，置于25 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濃度為0.5132 g·L-1。按上述色譜條件進(jìn)行測定，分別進(jìn)樣1、2、4、6、8、10、15、20 μL，以對照品的進(jìn)樣量(μg)對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為:Y(峰面積)=1.56X+5.25，r=0.999，結(jié)果表明絞股藍(lán)皂苷XL IX在0.513～10.254 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)取樣品(批號：20120226 )按供試品溶液的制備方法制備6份溶液進(jìn)行測定。測得取樣量，代入公式計(jì)算。絞股藍(lán)皂苷XL IX的平均含量為每粒1.27 mg，RSD為2.1%。

2.6加樣回收率試驗(yàn)精密稱定絞股藍(lán)皂苷XL IX 30.35 mg，置于25 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濃度為1.214 g·L-1。取6份上述對照品溶液2 mL置錐形瓶中，蒸干甲醇。取已知含量的樣品(批號：20120226)適量，精密稱定6份，分別置上述各錐形瓶中，按供試品溶液的制備方法制備溶液，測定回收率，結(jié)果得平均回收率為101.56%，RSD為2.4%。見表1。

表1　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7精密度試驗(yàn)取對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測定。絞股藍(lán)皂苷XL IX的保留時(shí)間和峰面積RSD分別為0.2%和1.0%，表明精密度良好。

2.8穩(wěn)定性試驗(yàn)取樣品(批號：20120226)按供試品溶液的制備方法制備5份溶液，分別于制備后0、5、10、15、19、22、26、31、35、40 h后測定峰面積，絞股藍(lán)皂苷XL IX含量的RSD為3.0%。表明樣品溶液在制備后40 h內(nèi)，絞股藍(lán)皂苷XL IX的量值穩(wěn)定。

2.9樣品測定采用上述2.1和2.2項(xiàng)下的方法，對 10批樣品進(jìn)行含量測定，葛蘭心寧軟膠囊中絞股藍(lán)皂苷XL IX的含量為每粒1.28~1.40 mg。

3討論

3.1提取方法考察對提取溶劑甲醇、水、10%甲醇為溶劑分別進(jìn)行了考察；對超聲、水浴回流等提取方式進(jìn)行了考察；考察了水飽和正丁醇的提取2、3、4次的樣品的含量以及正丁醇飽和的水洗滌的效果進(jìn)行了考察，根據(jù)樣品含量測定的結(jié)果，最終確定了以10%甲醇為提取溶劑進(jìn)行水浴回流，以水飽和正丁醇提取3次后，以正丁醇飽和的水進(jìn)行洗滌。

3.2轉(zhuǎn)移率測定取生產(chǎn)用的同批次絞股藍(lán)總苷的原料，測定其中絞股藍(lán)皂苷XL IX的含量，根據(jù)含量和處方量折算葛蘭心寧軟膠囊的理論值。實(shí)際測量值與理論含量的比值即為轉(zhuǎn)移率，測定的10批樣品的轉(zhuǎn)移率為87.5%~98.1%。

3.3關(guān)于絞股藍(lán)總苷的質(zhì)量控制方法據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道：有人以參皂苷Rb1為對照，利用UV法測定含量測定[5-6]，以絞股藍(lán)皂苷為對照品進(jìn)行定性鑒別[7]，進(jìn)行HPLC法絞股藍(lán)皂苷含量測定時(shí)利用的對照品還有人參皂苷Rb1[8]、絞股藍(lán)中絞股藍(lán)皂苷B[9]、絞股藍(lán)皂苷A。還有采用SPME-GC-MS法對5個(gè)不同地區(qū)絞股藍(lán)中揮發(fā)性成分進(jìn)行分析[10]。 以絞股藍(lán)皂苷XL IX為對照品進(jìn)行質(zhì)量控制為首次報(bào)道。

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Determination of Gypenoside XL IL in Gelan

Xinning soft capsule by HPLC-ELSD

YAN Bo1，WU Fang2,LIU Hai-jing1，2，et al

(1.ShaanxiUniversityofChineseMedicine,Xianyang,Shaanxi712046，China;

2.ShaanxiInstituteforFoodandDrugControlDrugControl,Xi’an,Shaanxi710061，China)

Abstract:ObjectiveToestablishadeterminationmethodofGypenosideXLILinGelanXinningsoftcapsulebyHPLC-ELSD.MethodsSampleswereanalyzedonaKromasilC18column(250mm× 4.6mm，5μm).Themobilephasewasacetonitrile-water(35:65).TheELSDdetectorwasused,withaflowrateofatomizerat2.8L·min-1andthetemperatureofdrifttubewas105℃.ResultsThemethodhadalinearrelationshipintherangeof0.513～10.254μg(r=0.999)andtheaveragerecoveryratewas101.56%(n=6).ConclusionsThemethodishighlyspecific,accurate,sensitiveandreproducible,whichcanbeusedforthequalitycontrolofGelanXinningsoftcapsule.

Keywords:GelanXinningsoftcapsule;HPLC;GypenosideXLIL;determination

(收稿日期：2014-03-12，修回日期：2014-06-09)

通信作者：劉海靜，女，主任藥師，碩士生導(dǎo)師,研究方向：藥物分析,E-mail: liuhaijing1@163.com

作者簡介：閻博，女，碩士研究生

基金項(xiàng)目：陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目(No 2013KTCQ03-14)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.015