比較人AB型血清與胎牛血清在結核桿菌裂解物刺激人外周血單個核細胞中的作用

金　亮，張　茜，沙　泉

(安徽醫科大學免疫學教研室及過敏與免疫研究中心，安徽 合肥　230032)

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比較人AB型血清與胎牛血清在結核桿菌裂解物刺激人外周血單個核細胞中的作用

金亮，張茜，沙泉

(安徽醫科大學免疫學教研室及過敏與免疫研究中心，安徽 合肥230032)

摘要:目的觀察添加人AB型血清或胎牛血清(FBS)培養基培養的人外周血單個核細胞(PBMC)在結核桿菌 (M.tb) 全菌裂解物 (WCL)的刺激下增殖差異。方法健康成人PBMC 1×109·L-1，分別加入WCL 20 mg·L-1，或者同時給予人重組白細胞介素-2(rhIL-2)50 U·mL-1，植物血凝素(PHA)5 mg·L-1，同時設置空白對照組。分別在含10%人AB型血清的RPMI1640培養液和10%FBS 的RPMIl640培養液中培養6 d后，用倒置顯微鏡觀察培養結果，運用流式細胞術檢測淋巴細胞增殖情況。結果添加人AB型血清培養基培養條件下，M.tbWCL對淋巴細胞增殖效果較同樣條件下添加FBS培養的增殖效果明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。在WCL和rhIL-2混合組中同樣是添加人AB型血清培養增殖效果明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。結論當以M.tbWCL為抗原的刺激人PBMC時，淋巴細胞在添加人AB型血清培養液中比在添加FBS的培養液中增殖效果更加明顯。

關鍵詞:結核分枝桿菌;人AB型血清;胎牛血清;外周血單個核細胞

結核病是一種嚴重危害人類生命健康的傳染病，根據世界衛生組織(WHO)2013年報告，全世界估算每年新增860萬結核患者，有約130萬人死于結核病(包括32萬艾滋病陽性者)，中國占新增病例數的12%，僅次于印度(26%)居世界第二位，而現有的抗結核藥物的副反應高達13%，在一些高齡，肝炎史，營養狀態低下的患者中副反應發生率更高，更嚴重[1]。如此高的患病率和高死亡數，令人難以承受，所以對結核病的防治和研究也一直是各國政府扶持的重點之一。

目前對M.tb的研究主要是運用M.tb的不同成分或者其自身分泌蛋白作為抗原，誘導不同的免疫細胞(γδT細胞、CD3+細胞等)發生反應，從而深入探究相關機制，以便于研制出新的疫苗或者抗結核藥物。例如M.tb的菌壁上含有大量的脂蛋白可以通過DC介導的MHCⅡ途徑上調IFN+CD4+細胞的表達，從而起到免疫保護作用[2]。由于此類研究一般都要進行體外細胞培養，而血清又是細胞體外培養中使用最廣泛的細胞培養基成分，含有豐富的細胞生長所必須的營養物質，是良好的添加劑。目前最主要的選擇是動物血清，如小牛血清，新生牛血清，以及胎牛血清等。因為胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少，所以胎牛血清的使用較為廣泛。然而FBS中依然存在可能的各種病毒，支原體和朊病毒等[3]。人AB型血清具有同源性，在骨髓間充質干細胞[4]，滑膜細胞[5]，人結膜上皮細胞[6]，施萬細胞[7]，臍靜脈內皮細胞[8]等細胞的研究表明與胎牛血清相比，用人AB型血清培養的細胞能更好的促使細胞增殖生長，保持其特有功能。本實驗目的就是探討兩種血清在PBMC增殖實驗中的效果。

1材料與方法

1.1M.tb抗原及其配制

1.1.1抗原種類由M.tbH37Rv株制備的全菌裂解物(H37Rv，Whole Cell Lysate，WCL，NR-14822)，由BEI Resources，美國國家過敏和傳染病研究所(NIAID)，美國國立衛生院(NIH)提供。

1.1.2抗原的配制WCL抗原采用無菌PBS稀釋至1 g·L-1。

1.2試劑和儀器淋巴細胞分離液，天津TBD公司；培養基RPMI1640，HyClone公司產品；胎牛血清(FBS)購于北京元亨金馬生物技術公司；人AB型血清，人白細胞濃縮液，安徽省合肥市紅十字中心血站；重組人白細胞介素2(rhIL-2)BD公司；流式細胞儀FACSVerse，BD公司；植物血凝素(PHA)，sigma；熒光染料 CFSE，invirtrogen； PI，sigma。

1.3人AB型血清制取取AB型血漿(n=5)混合，滅活后先置于-20℃中50 min，室溫下溶解后，再置于離心機15 000 rpm，1 h，4℃。之后取上清液并凍存于-20℃備用。

1.4CFSE染色人白細胞濃縮液經淋巴細胞分離液獲得PBMC，用不含血清的RPMI1640培養液調整至2×109·L-1的細胞懸液，加入CFSE(終濃度1 μmol·L-1)，37℃染色10 min后分別用含10%FBS的RPMI1640或10%AB血清的PRMI1640培養液洗滌，調整細胞濃度至0.5×109·L-1。

1.5抗原刺激培養將CFSE染色后的PBMC培養于96孔培養板中(圓底)每孔200 μL，設空白對照組，WCL組(20 mg·L-1)，陽性組PHA(5 mg·L-1)，以及WCL加IL-2(50 U·mL-1)，該組IL-2每3 d補充一次，劑量相同。連續培養6 d。

1.6細胞增殖分析(1)在培養初期至末期分別用倒置顯微鏡觀察細胞生長變化。(2)至第6天，收集細胞，洗滌后加入PI(100 mg·L-1)。用流式細胞術檢測，通過淋巴細胞的大小以及PI的特點，用門(gate)圈取活的淋巴細胞，再根據CFSE的熒光強度對門內細胞進行分析，所得數據分析采用Fcs Express軟件。

1.7統計學分析采用SPSS 17.0軟件進行方差檢驗，P<0.05具有統計學意義。

2結果

2.1外周血淋巴細胞生長的動態觀察各組在生長第一天兩種血清培養下的PBMC無明顯區別，隨著培養時間延長細胞開始分裂生長，并逐漸形成集落。對照組生長極為緩慢，至6 d時幾乎無明顯增長。PHA組增長則極為迅速至3 d時都以形成大團集落，但至6 d時集落變小，提示可能細胞開始死亡。至于WCL組初始無明顯區別，至6 d觀察，AB型血清組細胞增長FBS組較為明顯，集落較多，也較密(圖1)。

注：A、C：AB型血清培養組；A：培養1 d，C：培養6 d;B、D：FBS組；B：培養1 d，D: 培養6 d。

2.2外周血單核細胞增殖檢測運用流式細胞儀檢測CFSE的熒光強弱，分析淋巴細胞增殖情況，同時檢測PI以去除死細胞。運用統計學分析各組情況(圖2)。結果：空白對照組的兩種血清組均無明顯增殖，且差異無統計學意義(P>0.05)。PHA刺激條件下FBS組(77.0±23.76)%的淋巴細胞較AB型血清組(62.96±17.75)%增殖效果好，差異有統計學意義(P<0.05)。在WCL刺激條件下，人AB型血清組(31.57±18.69)%(圖3A)的淋巴細胞要比FBS組(15.99±9.15)%(圖3B)的增殖效果好，差異有統計學意義(P<0.05)，WCL加IL-2組中人AB型血清組(44.90±15.77)%(圖4A)的淋巴細胞比FBS組(30.79±13.27)%(圖4B)增殖效果好，差異有統計學意義(P<0.05)。

注：*P<0.05 vs FBS組，control組n=13，PHA組n=11，WCL組n=13，WCL+IL-2組n=9。

注：A：AB型血清組；B：FBS組。

注：A：AB型血清組；B：FBS組。

3討論

由于M.tb是胞內寄生菌，抗體無法進入胞內，所以人體對M.tb的免疫方式主要依靠細胞免疫，而細胞免疫多數都是依靠樹突狀細胞(DC)或者巨噬細胞抗原呈遞給T細胞，從而激活效應細胞，產生免疫效應[9-10]。而在單獨培養的DC中，若添加人AB型血清或者自體血清后，培養后的DC無論是在功能，特異性表面分子(CD83,CD86等)的表達上均要優于同等條件下添加胎牛血清或者無血清培養的DC[11]。此外在M.tb感染中IL-2、IL-4等細胞因子也起到了重要作用，特別是在未感染和已感染人群中存在顯著差異。對細胞因子的研究往往也需要進行體外實驗，但是在體外實驗時，由于需要較長的培養時間，才能使得免疫細胞活化增殖，所以為了避免細胞過早死亡，就需要一種優秀的添加劑。血清可以使得細胞在更好的環境中生長，特別是在培養周期較長的實驗中，其效果更加明顯。雖然血清中的有些成分對細胞的生長具有利的影響，例如大分子的蛋白質、核酸及營養因子等，對促進細胞的生長繁殖、黏附及中和某些毒性物質起著一定的作用，但是同時也含有一些會不利于細胞生長的物質，例如當球蛋白>20 g·L-1時，并在某些物質的作用下，就會出現影響細胞正常生長發育的細胞毒性作用。通過添加人AB型血清可以適當提高培養液中白蛋白的含量，降低球蛋白的含量，有利于細胞的生長[12]。此外血清中含有的血小板原生長因子(PDGF)可直接作用于細胞周期，使細胞周期轉換時間縮短，加速細胞的分裂和增殖[13]。而在人血清中的PDGF含量要高于其在FBS中的含量，這可能也是一個重要的因素[14]。在本實驗中，在PHA刺激條件下，FBS組淋巴細胞增殖較人AB型組多，可能是由于培養時間較長，導致營養液不夠，使得人AB型血清組中的細胞在較早時就開始死亡，而死亡細胞的成分又進一步抑制其他細胞增殖。而實驗組由于WCL不是有絲分裂原，需要較長時間才能使PMBC增殖。若是加入IL-2則能加快細胞增殖，維持細胞的生長。至于人AB型血清中是否還含有其他促進細胞生長的物質，或者是有能更好的促使M.tb裂解物誘導免疫細胞活化增殖的成分還待以后進一步的深入研究。本實驗表明在體外培養中，添加人AB型血清培養的淋巴細胞對M.tbWCL刺激的增殖效果明顯，可以作為良好的細胞培養基成分。

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關于文稿中法定計量單位的書寫要求

本刊法定計量單位實行國務院1984年2月頒布的《中華人民共和國法定計量單位》，并以單位符號表示，具體使用參照1991年中華醫學會編輯出版部編輯的《法定計量單位在醫學上的應用》一書。注意單位名稱與單位符號不可混合使用，如ng·kg-1·天-1應改為ng·kg-1·min-1；組合單位符號中表示相除的斜線多于1條時，應采用負數冪的形式表示，如ng/kg/min應采用ng·kg-1·min-1的形式；組合單位中斜線和負數冪亦不可混用，如前例不宜采用ng/kg·min-1的形式。在首次出現不常用的法定計量單位處用括號加注與舊制單位的換算系數，下文再出現時只列法定計量單位。人體及動物體內的壓力單位使用mmHg或cmH2O,但文中首次出現時用括號加注(1 mmHg=0.133 kPa)。正文中時間的表達，凡前面帶有具體數據者應采用d、h、min、s，而不用天、小時、分鐘、秒。量的符號一律用斜體字母，如吸光度(舊稱光密度)的符號為A,“A”為斜體字。

Comparsion of Mycobacterium tuberculosis Whole Cell Lysate effects on

proliferation of human peripheral blood mononucelear cells in

human AB type serum and fetal bovine serum

JIN Liang,ZHANG Xi,SHA Quan

(DepartmentofMedicalImmunologyandAllergyandImmunologyResearchCenter,

AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the proliferation difference of human peripheral blood mononucelear cells (PBMCs) which were stimulated with Mycobacterium tuberculosis (M.tb) Whole Cell Lysate (WCL) in human AB serum cell culture medium and fatal bovine serum (FBS) cell culture medium.MethodsPBMCs from healthy adults were stimulated by WCL or WCL with recombinant human interleukin 2 ( rhIL-2) or phytohemagglutinin (PHA) or none as control in four groups.Each of the groups was cultured with RPMI-1640 medium containing 10% AB serum or 10% FBS for six days respectively.The proliferation of lymphocytes was carefully investigated under the inverted microscope and flow cytometry.ResultsThe proliferation of lymphocytes stimulated by WCL in medium with 10% AB serum is better than that in medium with 10% FBS (P<0.05).Similar results were obtained when PBMCs were stimulated by WCL and rhIL-2 (P<0.05) .ConclusionWhen human PBMCs were stimulated withM.tbWCL,the proliferation of lymphocytes was better in the culture medium supplemented with human AB serum than in that with FBS serum.

Key words:mycobacterium tuberculosis;AB type of human serum;fetal bovine serum;PBMC

(收稿日期：2014-05-15，修回日期：2014-08-07)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.021

通信作者：沙泉，女，教授，碩士生導師，研究方向：過敏與氣道免疫，E-mail：qsha2@yahoo.com

作者簡介：金亮，男，碩士研究生

基金項目：國家自然科學基金(No 81273245);安徽省國際科技合作計劃(No 11030603027)