加味玉屏風(fēng)散及單味中藥對假絲酵母菌的體外抑菌作用

?

加味玉屏風(fēng)散及單味中藥對假絲酵母菌的體外抑菌作用

吳亞1，范世英2，魏宏蓮2，曹爽1

(1.河北省中醫(yī)院檢驗科；2.河北醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊050011)

摘要:目的觀察加味玉屏風(fēng)散及單味中藥對假絲酵母菌的體外抑菌效果，旨在尋求中藥在抗真菌方面的優(yōu)勢作用。方法用瓊脂稀釋法觀察加味玉屏風(fēng)散各組和單味中藥黃連、茵陳、炙黃芪對104株假絲酵母菌的體外抑菌作用。結(jié)果玉屏風(fēng)散+黃連、玉屏風(fēng)散+黃連+茵陳、黃連的抑菌效果較好，50%最低抑菌濃度(MIC50)分別為6.25、25.00、1.56 g·L-1，且對熱帶假絲酵母菌的抑菌效果最好，其次為光滑假絲酵母菌、白假絲酵母菌和葡萄牙假絲酵母菌，對近平滑假絲酵母菌抑菌效果較差。玉屏風(fēng)散和炙黃芪僅對熱帶假絲酵母菌有一定抑菌效果，未發(fā)現(xiàn)茵陳對假絲酵母菌有抑菌作用。結(jié)論黃連及含黃連的加味玉屏風(fēng)散對各種假絲酵母菌均有抑制作用，尤其是對耐藥率較高的非白假絲酵母菌有較強的抑菌功效。這點對臨床研究更有價值。

關(guān)鍵詞:加味玉屏風(fēng)散；黃連；茵陳；炙黃芪；假絲酵母菌；瓊脂稀釋法

隨著廣譜抗生素、免疫抑制劑以及侵入性診斷治療的應(yīng)用，真菌感染的發(fā)病率日益增加。但目前臨床上應(yīng)用的西藥抗真菌藥物，存在毒性大、耐藥性增加、費用高等缺點。為了尋找中藥在抗真菌方面的優(yōu)勢作用，筆者對加味玉屏風(fēng)散及幾種單味中藥用瓊脂稀釋法進行了體外抑菌試驗，尋求中藥對真菌的抑菌功效。

1材料

1.1菌株2013年3月至2014年3月河北省中醫(yī)院微生物室分離的假絲酵母菌104株，其中白假絲酵母菌48株，熱帶假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌各20株，近平滑假絲酵母菌12株，葡萄牙假絲酵母菌4株，菌株分別來自患者的血液、中段尿和痰液標(biāo)本。質(zhì)控菌株為白假絲酵母菌90028。

1.2培養(yǎng)基(1)RoswellParkMemorialInstitute1640(RPMI1640)液體培養(yǎng)基：將RPMI1640粉末20.8g，葡萄糖40g，用0.33mol·L-1三嗎琳基丙磺酸(MOPS)緩沖液溶解，同時用1mol·L-1氫氧化鈉(NaOH)調(diào)整pH值至6.9~7.1，最后定容至1L，過濾除菌備用。(2)4%瓊脂:將40g瓊脂溶于1 000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min，備用。

1.3藥液儲存液制備 (1)中藥制劑分組：A組：玉屏風(fēng)散(防風(fēng) ∶炙黃芪∶炒白術(shù)=1∶2 ∶2)；B組：玉屏風(fēng)散+黃連；C組：玉屏風(fēng)散+茵陳；D組：玉屏風(fēng)散+黃連+茵陳；E組：炙黃芪；F組：黃連；G組：茵陳。(2)將中藥按常法做成煎液，即每組取中藥總量100g，加適量蒸餾水浸泡30min,強火加熱煮沸，再以文火煎煮30min，紗布過濾，濾渣再加適量蒸餾水煎煮30min，過濾棄渣，合并濾液，加熱濃縮到0.1L，即相當(dāng)于原生藥1 000g·L-1。121℃高壓滅菌20min，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4主要儀器和試劑(1)高壓蒸汽消毒鍋：日本三洋株式會社產(chǎn)品；(2)電熱恒溫培養(yǎng)箱：南京智拓儀器儀表有限公司產(chǎn)品；(3)比濁儀：法國梅里埃生物制品公司產(chǎn)品；(4)MIT-P多點接種儀：日本佐久間制作所產(chǎn)品；(5)沙保羅平板、瓊脂粉、葡萄糖均購自杭州天和微生物試劑有限公司；(6)RPMI1640粉：美國LifeTechnologiesInc產(chǎn)品；(7)MOPS粉：Fluka公司產(chǎn)品；(8)黃連、茵陳、黃芪(蜜炙)、防風(fēng)、白術(shù)(炒)：均購于河北省藥材公司。

2方法

采用瓊脂稀釋法，對A~G組進行定量抑菌試驗。

2.1藥物平板制備將RPMI1640液體培養(yǎng)基與4%瓊脂于60℃ 1 ∶1混勻，分裝入試管中，每管分裝18mL,仍置60℃保溫。將倍比稀釋后的不同濃度的中藥液2mL加于試管中，輕輕振搖混勻，倒入直徑90mm平皿，置水平桌面使之凝固，最終配制成含中藥濃度為200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39g·L-1的藥物平板，并設(shè)不含中藥的瓊脂平板為生長對照，不接種菌液且不含中藥的瓊脂平板做空白對照。

2.2菌懸液制備將104株受試菌和質(zhì)控菌株(白假絲酵母菌90028)在沙保羅平板連續(xù)傳代培養(yǎng)2次，以確保菌落的純化和活力，第2次35℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)48h后取培養(yǎng)菌落用無菌生理鹽水分別配制成0.5麥?zhǔn)媳葷岬木鷳乙骸?/p>

2.3培養(yǎng)與觀察用MIT-P多點接種儀將配制好的0.5麥?zhǔn)媳葷峋鷳乙?0μL接種于含不同中藥濃度的藥物平板和生長對照平板上，于35℃培養(yǎng)48h，如果生長對照平板假絲酵母菌全部生長且空白對照平板無假絲酵母菌和雜菌生長，則觀察含中藥各藥物平板的最低抑菌濃度(MIC)，并統(tǒng)計出50%最低抑菌濃度(MIC50) 和90%最低抑菌濃度(MIC90)的藥物濃度和累積抑菌百分率；同時觀察對各中藥制劑組對各種假絲酵母菌的最低抑菌濃度范圍(MIC范圍)。

3結(jié)果

3.1各中藥制劑組對假絲酵母菌的抑菌作用通過對104株假絲酵母菌進行體外抑菌試驗，結(jié)果表明黃連(F組)的抑菌效果最好，MIC50和MIC90分別為1.56g·L-1和6.25g·L-1，其次是玉屏風(fēng)散+黃連(B組)和玉屏風(fēng)散+黃連+茵陳(D組)，其MIC50分別為6.25g·L-1和25.00g·L-1，茵陳(G組)的抑菌效果最差。結(jié)果見表1。

表1　各中藥制劑組對104株假絲酵母菌

3.2各中藥制劑組對104株假絲酵母菌的累積抑菌百分率見表2。

表2　各中藥制劑組對104株假絲酵母菌的累積抑菌率比較/%

3.3各中藥制劑組對各種假絲酵母菌的抑菌作用玉屏風(fēng)散+黃連(B組)和玉屏風(fēng)散+黃連+茵陳(D組)和黃連(F組)對熱帶假絲酵母菌的抑菌效果最好，其次為光滑假絲酵母菌和白假絲酵母菌，對近平滑假絲酵母菌抑菌效果最差；玉屏風(fēng)散(A組)和炙黃芪(E組)僅對熱帶假絲酵母菌有一定抑菌作用。茵陳(G組)未檢出抑菌作用結(jié)果見表3。

表3　各中藥制劑組對各種假絲酵母菌的MIC范圍/g·L-1

4討論

近年來隨著抗生素、激素、免疫抑制劑等藥物以及介入治療的廣泛應(yīng)用，臨床上真菌感染的比例大大增加，對抗真菌藥物的耐藥問題也越來越突出，因此，開發(fā)研究既可有效對抗真菌感染，毒副作用又較小，適合免疫力低下人群使用的抗真菌藥物顯得越來越重要。本試驗采用瓊脂稀釋法，進行了復(fù)方中藥和單味中藥對104株假絲酵母菌的體外抑菌試驗，試驗發(fā)現(xiàn)，玉屏風(fēng)散+黃連、玉屏風(fēng)散+黃連+茵陳、黃連對假絲酵母菌具有較強的體外抑菌作用，其 MIC50分別為6.25、25.00和1.56 g·L-1，且對熱帶假絲酵母菌抑菌作用最強，對白假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌次之，對葡萄牙假絲酵母菌也有一定的抑制作用，對近平滑假絲酵母菌較差。與胡吉生等[1]報導(dǎo)黃連對念珠菌體外試驗具有較強的抑菌作用,且黃連的抑菌效果最好相符。近年來非白假絲酵母菌(包括熱帶假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、葡萄牙假絲酵母菌等)引起的感染越來越受重視，這些非白假絲酵母菌對常用抗真菌藥物氟康唑都表現(xiàn)出較高的耐藥性[2]，本試驗中無論是單味中藥黃連還是含黃連的復(fù)方中藥組都觀察到了對非白假絲酵母菌有較強的抑菌作用。黃連的臨床功效很強大，除了對產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶和不產(chǎn)酶的大腸埃希菌有抑菌作用[3]外，黃連的主要成分小檗堿對白假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌的生長均具抑制作用[4]。和劉濤峰等[5]報道黃連對白假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌等的標(biāo)準(zhǔn)菌株均有較強的抑菌作用一致。這一抑菌作用為臨床上對抗非白假絲酵母菌感染指出了一條可行之路。

假絲酵母菌屬引起的感染屬于機會性感染，常見于免疫力低下人群[2]。玉屏風(fēng)散，被稱為中藥免疫調(diào)節(jié)劑，主治表虛自汗，易感風(fēng)邪。玉屏風(fēng)散能夠使單純腎病綜合征患兒免疫功能增強,繼發(fā)性復(fù)發(fā)與感染的概率得到明顯降低[6-7]。玉屏風(fēng)散中的黃芪的重要化學(xué)成分黃芪多糖具有多種功效,包括增強機體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗衰老等廣泛功效[8]。白術(shù)能夠提高細胞免疫功能和體液免疫功能。防風(fēng)有祛風(fēng)、鎮(zhèn)痛、發(fā)汗、解熱、抗菌之作用。在假絲酵母菌感染治療時，玉屏風(fēng)散+黃連和玉屏風(fēng)散+黃連+茵陳不僅能提高機體免疫力，也能發(fā)揮抑制真菌作用。試驗中未發(fā)現(xiàn)茵陳的抗真菌作用，這與章林平等[9]報道茵陳揮發(fā)油中的茵陳炔酮有抑制真菌作用結(jié)果不一致，這可能與中藥的提取方式有關(guān)。有些具有抑制真菌作用的成分可能不溶于水，或者煎煮時不耐受高溫而被破壞或揮發(fā)，影響了抑菌效果，這些有待于進一步研究和改進工藝。

總之，無論是黃連還是含黃連的加味玉屏風(fēng)散制劑對假絲酵母菌都有較強的抑制作用，有研究表明[10]氟康唑與鹽酸小檗堿對耐藥真菌的協(xié)同作用,是通過增加真菌胞內(nèi)的鹽酸小檗堿含量。可見，中西醫(yī)結(jié)合治療真菌感染也是一條可行之路。

參考文獻:

[1]胡吉升,胡志敏,童中勝,等.17味單味中藥煎劑對陰道致病念珠菌的體外抑菌試驗研究 [J].湖北中醫(yī)雜志,2013,35(6):23-24.

[2]李慧平,常婧.臨床常見假絲酵母菌屬的分布及耐藥分析[J].中華醫(yī)院感染雜志,2012,22(22):5157-5159.

[3]許韋,邵志偉,李小東,等.黃岑等10種中藥對大腸埃希菌的體外抑菌試驗觀察[J]. 安徽醫(yī)藥,2013,17(5):846-848.

[4]周笑梅,寧玉梅.單味中藥抑制白假絲酵母菌作用的研究進展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2011, 29(3):580-581.

[5]劉濤峰,鄭玉榮,劉小平,等.10種中藥水煎劑對念珠菌的體外抑菌作用[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2012,21(4):72-74.

[6]朱香蘭.玉屏風(fēng)散治療單純性腎病綜合征兒童繼發(fā)性免疫功能低下臨床研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2014,41(4):749-750.

[7]韋蓉,阮毅燕,邱玉芬,等.玉屏風(fēng)顆粒對原發(fā)性腎病綜合征兒童體液免疫功能影響的研究[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2013,22(11):1211-1212.

[8]柏冬志,東方,唐文婷,等.黃芪多糖藥理作用的研究進展[J]. 黑龍江醫(yī)藥，2014,27(1):103-106.

[9]章林平,孫倩,王威,等.茵陳有效成分的藥理作用及其臨床應(yīng)用的研究進展[J]. 抗感染藥學(xué),2014,11(1):28-31.

[10] 王曉飛.氟康唑和小檗堿的真菌胞內(nèi)含量及協(xié)同抗耐藥機制研究[D]. 福州:福建中醫(yī)藥大學(xué),2013.

常用醫(yī)學(xué)名詞術(shù)語的規(guī)范表達

Inhibition test of the flavored yupingfeng powder and single traditional

Chinese medicine against candida in vitro

WU Ya1,FAN Shi-ying2, WEI Hong-lian2, et al

(1.HebeiTraditionalChineseMedicalHospital;2.TheSecondHospitalAffiliated

toHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China)

Abstract:ObjectiveThroughobservingthein vitroinhibitioneffectsofflavoredyupinfengpowderandsingletraditionalChinesemedicineagainstcandida,toseektheantifungaleffectsoftraditionalChinesemedicine(TCM) .MethodsUsingAGARdilutionmethodtoobservein vitroinhibitioneffectoftheflavoredyupingfengpowderandsingletraditionalChinesemedicine(e.g.,rhizomacoptidis,herbaartemisiae,RadixAstragalipreparata)to104strainsofcandida.ResultsFungiinhibitioneffectsofYupingfengpowder+rhizomacoptidis,yupingfengpowder+rhizomacoptidis+herbaartemisiae,andrhizomacoptidisaregood.Theminimalinhibitoryconcentrationsof50% (MIC50)were6.25, 25.00and1.56g·L-1,respectively.Tropicalcandidashowedbestinhibitoryresponse,followedbysmooth-candida,whitecandidaandportugalcandida,whilenearlysmoothcandidatheworst.YupingfengpowderandRadixAstragalipreparatahascertainantifungaleffectsonlyfortropicalcandida.Herbaartemisiaedidn’tshowanyantifungaleffects.ConclusionsRhizomacoptidisandtheflavoredyupingfengpowderwithcoptishasstronginhibitionefficacyforavarietyofcandida,especiallyforthenon-Candidaalbicanswithhigherpercentages.Itismorevaluableforclinicalresearch.

Keywords:theflavoredyupinfengpowder;rhizomacoptidis;herbaartemisiae;radixastragalipreparata;candida;AGARdilutionmethod

(收稿日期：2014-06-26，修回日期：2014-07-28)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.055

基金項目：河北省中醫(yī)藥管理局2013年科研計劃項目(No 2013048)