轉錄因子USF1調控雞小腸上皮細胞中糖類轉運蛋白表達

張利環，李玲香，張 瑜，原一桐，王文魁，朱芷葳，王欽德，李慧鋒＊

（1.山西農業大學生命科學學院，太谷030801；2.山西農業大學動物科技學院，太谷030801）

糖類是動物體內不可或缺的營養物質，具有提供能量、構成細胞骨架、物質代謝的碳骨架等生物學功能，只有在體內轉化為葡萄糖、果糖、半乳糖等基本的單糖后才可以被腸道上皮細胞所吸收利用。在細胞膜內外，單糖跨膜轉運的實現主要由糖類營養轉運蛋白來完成［1-2］。其中，葡萄糖轉運體（Glucose transporter，GLUT）是一類調控細胞外葡萄糖進入細胞內的跨膜蛋白家族，參與糖代謝、炎性反應和免疫應答等過程［3］。鈉-葡萄糖協同轉運蛋白（Sodiumdependent glucose transporter，SGLTs）是一類位于小腸黏膜和腎近曲小管細胞中的葡萄糖轉運蛋白家族，其中鈉離子依賴性葡萄糖轉運蛋白SGLT1在小腸葡萄糖的吸收中發揮重要作用［4-5］。糖類營養轉運蛋白基因何時表達、腸道不同部位的表達特點以及表達量等都要受到多種轉錄調控因子的調控［6］。

上游刺激因子（Upstream stimulatory factor，USF）屬于進化高度保守性堿性-螺旋-環-螺旋-亮氨酸拉鏈（Basic helix-loop-helix，b HLH）蛋白家族成員，主要包括USF1和USF2兩種，能結合靶基因DNA上的E-box位點而發揮轉錄調節作用。其中，USF1可作用于多種靶基因，在糖脂代謝、細胞增殖、刺激前列腺素合成和黑素沉積等過程中發揮重要作用［7-9］。有研究表明，在肝中單糖轉運蛋白基因和肝丙酮酸激酶（L-PK）mRNA表達量隨葡萄糖濃度升高而增高，這些基因的5′調控區都存在著葡萄糖應答元件（Glucose response element，GLRE），USF蛋白形成復合體結合到葡萄糖應答元件上，增強L-PK基因的表達［10］。GLUT 2基因同樣受到葡萄糖濃度的影響，其表達量變化與L-PK 基因相似［11］，但其受USF1調控的機制卻沒有L-PK基因研究的詳細。

本研究通過構建USF 1真核表達載體，在雞小腸上皮細胞中過表達USF 1，利用實時熒光定量PCR檢測糖轉運蛋白GLUT2、GLUT5和SGLT1的表達變化，分析轉錄因子USF1在小腸上皮細胞中對單糖轉運蛋白基因的表達影響。研究結果不僅對研究雞腸道營養吸收的分子調控機理有重要的理論意義，而且可以為以提高飼料轉化率為目的的選育實踐提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本研究以山西康牧禽業提供的海蘭褐蛋雞15日齡雞胚若干作為腸道上皮細胞原代培養的細胞來源。

1.2 主要試劑藥品

Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko購自日本Sigma公司；Recombinant Mouse EGF購自美國加州Bio Legend公司；Mouse Anti-Cytokeratin 18 Monoclonal Antibody購自美國Millipore公司；濃縮型DAB試劑盒、免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司；Lipofectamine 2000 Reagent、Trizol Reagent購自美國Invitrogen生物技術公司；SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit（Perfect Real Time）、第一條鏈合成試劑盒、T載體、pcDNA3.1載體、rTaq酶、限制性內切酶Eco R I、Xho I、T4連接酶、DL2000 Marker等購自大連TaKaRa公司；其他常規生化試劑均為試驗級分析純。

1.3 洗液的配制

1號洗液：38.0 m L PBS中加入青鏈霉素混合液2.0 m L，使雙抗最終含量為5%；2號洗液：38.8 m L PBS中加入青鏈霉素混合液1.2 m L，使雙抗最終含量為3%；3號洗液：39.6 m L PBS中加入青鏈霉素混合液0.4 m L，使雙抗最終含量為1%。

1.4 引物設計

根據GenBank中雞及相關禽類USF 1、SGLT 1、GLUT 2和GLUT 5（GenBank登錄號分別為NM＿001007485.1、XM＿415247、NM＿207178和XM＿004947448）的基因信息，進行同源性比對，利用Primer5.0軟件設計引物。引物信息見表1，在USF 1基因編碼區的克隆引物中添加Eco R I與Xho I限制性內切酶位點。

1.5 真核表達載體的構建

以雞小腸cDNA為模板，擴增USF 1基因的CDS區，擴增片段經純化后，采用Eco R I與Xho I雙酶切，與pcDNA3.1載體進行連接，用酶切法和測序法對重組質粒進行鑒定。

1.6 雞IEC體外分離培養及鑒定

1.6.1 雞IEC體外分離培養 取15日齡雞胚，分離小腸，去除腸系膜，于超凈臺清洗多次，剪成1 mm3的組織塊，放入盛有2倍體積50μg·m L-1嗜熱菌蛋白酶HEPES消化液，37℃80 r·min-1振蕩消化120 min。用PBS稀釋酶消化液，反復多次稀釋吹打至懸浮液清亮，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。采用相差貼壁法接種，細胞密度約為6.5×105個·m L-1，于40℃7%CO2培養箱進行培養，按時觀察細胞貼壁生長狀態。

表1 PCR引物Table 1 PCR primers

1.6.2 雞小腸上皮細胞鑒定 通過形態學觀察、細胞生長計數等方法初步鑒定原代IEC細胞。細胞角蛋白18（Cytokeratin 18，CK18）是上皮組織特異性的抗原成分，采用免疫組化法檢測CK18在細胞中的表達。

1.7 轉染雞小腸上皮細胞

體外分離培養的IEC培養至第6天時，從中挑選生長狀態良好、長勢大致相同的9孔細胞換完全培養液，培養12 h后用Lipofectamine 2000轉染重組質粒pcDNA3.1-USF1，設置空載體組和不轉染組作為對照，在每組中設立6個重復，于40℃7% CO2培養箱內培養，48 h后，觀察細胞形態學變化，收集細胞及上清。

收集細胞于1.5 m L RNaseFree的離心管中，采用Trizol裂解法提取總RNA，紫外分光光度法測量濃度及純度，用1%甲醛變性凝膠電泳檢測。按照Ta KaRa反轉錄說明書合成cDNA第一條鏈，-20℃保存。

1.8 檢測USF 1、SGLT1、GLUT2和GLUT5基因的表達量

依據Ta KaRa公司2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ定量試劑盒，篩選各引物的最佳體系和反應條件，建立了USF 1、SGLT1、GLUT2和GLUT5基因的標準曲線，檢測USF 1、SGLT1、GLUT2和GLUT 5基因的表達量，獲得各樣本c DNA相應基因的表達拷貝數。

1.9 統計分析

應用SAS 8.1統計軟件進行方差分析，采用Duncans法進行多重比較，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 USF 1基因CDS區片段的擴增

PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳30 min后，結果顯示，PCR擴增產物條帶清晰，前后無非特異性條帶出現，約952 bp，與預計相符（圖1）。

圖1 USF 1基因PCR擴增產物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR products of USF 1 gene

2.2 pcDNA3.1-USF1重組質粒鑒定結果

重組載體pcDNA3.1-USF1經過限制性內切酶Eco R I和Xho I進行雙酶切，1%的瓊脂糖凝膠電泳后，可清晰看到酶切出的兩個條帶，與預期的條帶相符。這表明已成功構建了真核表達載體pcDNA3.1-USF1，其全長6 368 bp，USF 1插入位點為958～1 898 bp，如圖2。構建的真核表達載體經過測序分析，結果顯示所測序列與對應已知序列相符。

圖2 pcDNA3.1-USF1酶切產物電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of plasmid pcDNA3.1-USF1 endonuclease digestion

2.3 雞IEC形態學鑒定

純化獲得的IEC在40℃7%CO2培養箱內培養1 d后貼壁生長，并呈島嶼狀分布，之后IEC逐漸向四周漂移蔓延，在7、8 d時進入對數生長期，IEC匯合成片呈“鋪路石狀”分布，多為多角形、卵圓形和圓形（圖3），生長時IEC呈膜狀移動，成片生長，很少單個細胞單獨貼壁生長。

2.4 細胞生長曲線

通過計數法測定細胞生長曲線，細胞生長曲線呈“S”型（圖4），有一段約48 h的潛伏期或緩慢生長期，此后，細胞進入指數生長期或對數生長期，在指數生長期，細胞的倍增時間為60～96 h，培養后期細胞生長率下降，由于產生接觸抑制和密度抑制，細胞生長緩慢或停止生長，有些細胞甚至死亡。

圖3 IEC形態學鑒定圖Fig.3 The morphological identification of IEC

圖4 雞小腸上皮細胞原代培養生長曲線Fig.4 Growth curve of chicken intestinal epithelial cells

2.5 雞IEC免疫組化鑒定

CK18是上皮組織中特異性的抗原蛋白，對雞IEC進行免疫組化鑒定時，在試驗組中滴加鼠抗雞CK18單克隆抗體，在對照組中選用PBS代替一抗。光學倒置顯微鏡下觀察發現（圖5），試驗組細胞漿呈棕黃色為陽性，而對照組細胞漿未著色。

2.6 雞IEC轉染后形態學觀察

細胞經轉染48 h后在倒置顯微鏡下觀察質粒轉染組、陰性對照組和空白對照組細胞生長狀態，如圖6。空白對照組中，細胞之間緊密相連呈“鋪路石狀”分布，多為多角形、卵圓形和圓形，細胞明亮且邊界清晰；而經添加Lipofectamine 2000的轉染組和陰性對照組，IEC形態發生明顯的變化，IEC變暗形態不規則、邊界不明顯且細胞之間間隙加大失去原有的IEC形態特點。

2.7 各基因定量PCR標準曲線及熔解曲線

本研究中4條基因檢測的標準曲線，各R2均大于0.98，擴增效率在92%～100%，標準曲線均符合條件（圖7）。

USF 1、SGLT1、GLUT2和GLUT5基因的熔解曲線如圖8所示，可以觀察到每條熔解曲線只有單一峰，說明PCR擴增產物的特異性很好。

圖8 雞小腸基因USF 1、GLUT2、GLUT5和SGLT1熔解曲線Fig.8 The melting curves of USF 1，GLUT2，GLUT5 and SGLT1 in chicken small intestine

2.8 USF 1、SGLT1、GLUT2和GLUT5基因表達量的測定

表2為基因表達分析結果，質粒轉染組USF 1 mRNA表達量較空白對照組、陰性對照組極顯著增高（P＜0.01）。其中，質粒轉染組USF 1 mRNA表達量分別是空白對照組和陰性對照組的2.83和2.35倍。

表2 不同轉染組內各基因絕對表達量Table 2 Absolute expression of genes in different transfection groups

重組質粒pcDNA3.1-USF1成功轉染IEC后，質粒轉染組GLUT 2 m RNA表達量較空白對照組和陰性對照組極顯著增高（P＜0.01）。其中，質粒轉染組GLUT 2 mRNA表達量分別是空白對照組和陰性對照組的1.92和1.58倍；質粒轉染組GLUT 5 mRNA表達量與空白對照組、陰性對照組間差異不顯著（P＞0.05）；質粒轉染組SGLT1 mRNA表達量較空白對照組和陰性對照組極顯著增高（P＜0.01）。其中，質粒轉染組SGLT1 mRNA表達量分別是空白對照組和陰性對照組的1.54和1.30倍。

3 討 論

3.1 影響細胞轉染效率因素的探討

陽離子脂質體介導的細胞轉染方法具有轉染效率高，可重復性強等特點，因而被廣泛應用。轉染效率的高低主要與細胞接種密度、細胞的傳代次數、脂質體與質粒DNA的比例、血清的含量等因素有關。本試驗所使用的轉染試劑是脂質體Lipofectamine2000。為了避免出現脂質體轉染時對細胞毒性大，引起部分細胞死亡的情況，進行試驗時適當減少了重組質粒DNA的用量，在雞IEC細胞的匯合度達到80%～90%時進行試驗，并設計脂質體用量，篩選出最佳比例。最終確定質粒DNA與脂質體的比例為1∶2時轉染效果最好。

3.2 雞IEC體外分離培養

近年來，體外分離培養IEC被作為研究探討腸道的生物學功能、營養物質在腸道中吸收及調控機制的主要手段。雞ICE體外分離培養不僅對研究雞腸上皮細胞增殖、分化以及凋亡規律提供了理論依據，而且為研究營養素與外界因素對腸上皮的作用機制提供了理想的體外模型［12-13］。

獲得高純度的上皮細胞是本研究的關鍵環節之一。賈國東等在試驗中選用20日齡的雞胚，對腸組織分離后，采用刮取法得到腸絨毛及隱窩單位，然后在體外與成纖維細胞共同培養獲得了活性較高的腸上皮細胞［14］。古少鵬等將消化后的雞盲腸上皮細胞種植到含10%血清的細胞培養液中，1.5 h后把培養液連同未貼壁的細胞轉移到離心管中離心5 min，細胞沉淀重新加入含2.5%胎牛血清的細胞培養液懸浮，后接種于培養板中可以獲得較高純度盲腸上皮細胞［15］。本試驗在前人研究基礎上，將消化分離得到的IEC接種到含10%雞血清的細胞培養液中培養70 min后，收集未貼壁的細胞于含2.5%雞血清的細胞培養液中培養可以獲得較高純度的雞小腸上皮細胞。

3.3 USF 1基因過表達對SGLT1、GLUT2基因表達量的影響

轉錄因子USF最初是作為腺病毒晚期啟動子的反式激活因子而被發現的［16］，USF1與糖脂吸收機制密切相關［17-18］。S.Wu等人在小鼠體內過表達人類轉錄因子USF1后，發現小鼠體內的新陳代謝特征包括肥胖、膽固醇水平、膽固醇LDL／VLDL比值和葡萄糖／胰島素比值等均有顯著變化［19］。C.Weigert等研究發現，轉錄生長因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）啟動子的-1 013～-1 002區域與葡萄糖響應元件有高度的同源性，轉錄因子USF在高糖狀態下正調控基因TGF-β1啟動子活性［20］。目前，轉錄因子USF影響糖轉運蛋白表達的相關研究報道非常少。C.P.Corpe等人研究發現，GLUT5在組織分布、對小腸中果糖含量的敏感度等方面存在差異性表達，并推測可能與GLUT5基因5′區域存在尾側型同源基因（Caudal homeobox gene，Cdx A）、USF和Y染色體性別決定區（Sex-determining region of Y，SRY）結合位點有關［21］。J.Barrenetxe等人研究發現，人上皮細胞系Caco-2細胞質膜中GLUT 5和SGLT1基因的表達受TNFα調控，并進而導致糖轉運的改變［22］。在肝細胞中，轉錄因子USF形成的復合體可以結合在L-PK基因5′調控序列的葡萄糖應答元件上，對L-PK基因的表達產生影響［23］。作為葡萄糖誘導表達的同類基因［24-25］，GLUT2在肝細胞中的表達方式與L-PK基因類似。本研究中，重組質粒pc DNA3.1-USF1成功轉染IEC后，質粒轉染組GLUT2和SGLT 1 m RNA表達量均極顯著高于空白對照組和陰性對照組，表明轉錄因子USF1過表達對糖轉運蛋白基因GLUT 2和SGLT 1起正調控作用。分析其作用機制可能是USF1蛋白與這兩個基因的上游5′調控區的葡萄糖應答元件形成復合體，進而促進它們的表達。

4 結 論

本研究將USF 1基因真核表達載體轉染到小腸上皮細胞，使其過量表達，并測定了相關糖類轉運蛋白基因的表達量。證明在原代培養的雞小腸上皮細胞中，USF 1基因的過表達在m RNA水平上調了GLUT2和SGLT1基因的表達。

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）：

［1］ WRIGHT E M，MARTIN M G，TURK E.Intestinal absorption in health and disease-sugar［J］.Best Pract Res Clin Gastroenterol，2003，17（6）：943-956.

［2］ THORENS B，MUECKLER H.Glucose transporters in the 21st century［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2010，298（2）：141-145.

［3］ BARONE S，FUSSELL S L，SINGH A K，et al.Slc2a5（Glut5）is essential for the absorption of fructose in the intestine and generation of fructose-induced hypertension［J］.JBiol Chem，2009，284（8）：5056-5066.

［4］ SCHULZE C，BANGERT A，KOTTRA G，et al.Inhibition of the intestinal sodium-coupled glucose transporter 1（SGLT1）by extracts and polyphenols from apple reduces postprandial blood glucose levels in mice and humans［J］.Mol Nutr Food Res，2014，58（9）：1795-1808.

［5］ ARTHUR S，COON S，KEKUDA R，et al.Regulation of sodium glucose co-transporter SGLT1 through altered glycosylation in the intestinal epithelial cells［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1838（5）：1208-1214.

［6］ ISHII Y，FUKUDA K，SAIGA H，et al.Early specification of intestinal epithelium in the chicken embryo：a study on the localization and regulation of Cdx A expression［J］.Dev Growth Differ，1997，39（5）：643-653.

［7］ MARCIN R，AURELIA W D，ANNA S，et al.Upstream stimulating factors regulate the expression of RORγT in human lymphocytes［J］.J Immunol，2012，189（6）：3034-3042.

［8］ SIMON A，PENELOPE H，SELMA M S，et al.Potential role of upstream stimulatory factor 1 gene variant in familial combined hyperlipidemia and related disorders［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012，32（6）：1535-1544.

［9］ NAUKKARINEN J，NILSSON E，KOISTINEN H A，et al.Functional variant disrupts insulin induction of USF1：mechanism for USF1-associated dyslipidemias［J］.Circ-Cardiovasc Genet，2009，2（5）：522-529.

［10］ HASEGAWA J，OSATOM K，WU R F，et al.A novel factor binding to the glucose response elements of liver pyruvate kinase and fatty acid synthase genes［J］.J Biol Chem，1999，274（2）：1100-1107.

［11］ ANTOINE B，LEFRANCOIS-MARTINEZ A M，LE G G，et al.Role of the GLUT 2 glucose transporter in the response of the L-type pyruvate kinase gene to glucose in liver-derived cells［J］.J Biol Chem，1997，272（29）：17937-17943.

［12］ 胡龍昌，方熱軍.神經肽Y對豬小腸上皮細胞NaPi-Ⅱb蛋白表達及無機磷吸收的影響［J］.畜牧獸醫學報，2014，45（10）：1640-1647.HU L C，FANG R J.Effect of Neuropeptide Y on expression of NaPi-Ⅱb protein and absorption of inorganic phosphorus in porcine small intestinal epithelial cells［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2014，45（10）：1640-1647.（in Chinese）

［13］ GROSSMANN J，WALTHER K，ARTINGER M，et al.Progress on isolation and short-term ex-vivo culture of highly purified non-apoptotic human intestinal epithelial cells（IEC）［J］.Eur J Cell Biol，2003，82（5）：262-270.

［14］ 賈國東，趙毅博，劉冠群，等.雞腸上皮細胞原代培養方法的改進研究［J］.中國家禽，2012，34（19）：25-28.JIA G D，ZHAO Y B，LIU G Q，et al.Improvement of primary culture method for chicken intestinal epithelial cells［J］.China Poultry，2012，34（19）：25-28.（in Chinese）

［15］ 古少鵬，王敏霞，鄭明學，等.雞胚盲腸上皮細胞原代培養與鑒定［J］.畜牧獸醫學報，2009，40（11）：1699-1704.GU S P，WANG M X，ZHENGM X，et al.Study on primary culture and identification of cecum epithelial cells from chicken embryo［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2009，40（11）：1699-1704.（in Chinese）

［16］ GREGOR P D，SAWADOGO M，ROEDER R G.The adenovirus major transcription factor USF is a member of the helix-loop-helix group of regulatory proteins and binds to DNA as a dimmer［J］.Genes Dev，1990，4（10）：1730-1740.

［17］ MATSUDA M，TAMURA K，MAEDA A.Upstream stimulatory factors 1 and 2 mediate the transcription of angiotensin II binging and inhibitory protein［J］.J Biol Chem，2013，288（26）：19238-19249.

［18］ SANCHEZ A P，ZHAO J H，YOU Y，et al.Role of the USF1 transcription factor in diabetic kidney disease［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2011，301（2）：271-279.

［19］ WU S，MAR-HEYMING R，DUGUM E Z，et al.Upstream transcription factor 1 influences plasma lipid and metabolic traits in mice［J］.Hum Mol Genet，2010，19（4）：597-608.

［20］ WEIGERT C，BRODBECK K，SAWADOGO M，et al.Upstream stimulatory factor（USF）proteins induce human TGF-β1 gene activation via the glucose-response element-1013／-1002 in mesangial cells［J］.J Biol Chem，2004，279（16）：15908-15915.

［21］ CORPE C P，BOVELANDER F J，MUNOZ C M，et al.Cloning and functional characterization of the mouse fructose transporter，GLUT5［J］.Biochim Biophys Acta，2002，1576（1-2）：191-197.

［22］ BARRENETXE J，SANCHEZ O，BARBER A，et al.TNFαregulates sugar transporters in the human intestinal epithelial cell line Caco-2［J］.Cytokine，2013，64（1）：181-187.

［23］ MORIIZUM S，GOURDON L，LEFRANCOIS-MARTINEZ A M，et al.Effect of different basichelix-loophelixleucinezipper factors on the glucoseresponseunit of the L-typepyruvatekinasegene［J］.Gene Expression，1998，7（2）：103-113.

［24］ RENCUREL F，WAEBER G，ANTOINE B，et al.Requirement of glucose metabolism for regulation of glucose transporter type 2（GLUT2）gene expression in liver［J］.Biochem J，1996，314（Pt 3）：903-909.

［25］ ASANO T，KATAGIRI H，TSUKUDA K，et al.Upregulation of GLUT2 mRNA by glucose，mannose，and fructose in isolated rat hepatocytes［J］.Diabetes，1992，41（1）：22-25.