我國東、西方蜜蜂中七種病毒感染狀況的調查

丁桂玲，石 巍

（中國農業科學院蜜蜂研究所農業部授粉昆蟲生物學重點開放實驗室，北京100093）

蜜蜂是重要的授粉昆蟲，全球約35%的糧食生產作物都依賴于傳粉動物［1］，其中大約90%的商業授粉服務都由西方蜜蜂（Apis mellifera）完成。但多種病毒及病原體的侵擾，嚴重阻礙了蜜蜂群體的健康發展［2］。蜜蜂病毒病分布很廣，目前已發現的病毒超過18種［3-4］，其中感染蜂群較為頻繁的包括：殘翅病毒（deformed wing virus，DWV）、黑色王臺病毒（black queen cell virus，BQCV）、囊狀幼蟲病病毒（sac brood virus，SBV）、慢性麻痹病病毒（chronic bee paralysis virus，CBPV）、急性麻痹病病毒（acute bee paralysis virus，ABPV）、以色列急性麻痹病病毒（Israeli acute paralysis virus，IAPV）以及克什米爾蜜蜂病毒（Kashmir bee virus，KBV）。

DWV在世界范圍內廣泛流行，通常在大蜂螨（Varroa destructor）寄生蜂群之前作為隱性感染存在，可造成蜜蜂的翅膀畸形，工蜂、雄蜂壽命縮短［5］。在西方蜜蜂中，BQCV與微孢子蟲的感染密切相關［6］，但東方蜜蜂（Apis cerana）感染BQCV的報道很少。SBV主要感染蜜蜂的幼蟲，常常對東方蜜蜂造成很大危害。1972年，囊狀幼蟲病在我國廣東省暴發，2008年在遼寧省流行［7］。近幾年SBV在我國北京等地發病較重，2009—2010年間部分地區的東方蜜蜂發病率達100%［8］，給蜂群帶來嚴重損失。CBPV主要影響成年蜂，受CBPV感染的蜜蜂會表現出腹部顫抖、無毛、黑化等特征，營養缺乏以及不良的天氣條件都可能促進該病毒的暴發［4，9］。ABPV、KBV及IAPV親緣關系較近，同屬于二順反子病毒科，在西方蜜蜂中普遍存在［10］，2012年在中國的東方蜜蜂中檢測到IAPV［11］。

中國已有三千多年的養蜂歷史，主要的本土蜜蜂資源為東方蜜蜂。19世紀末西方蜜蜂引入中國并很快成為當家蜂種，分布于全國各地，而我國原有東方蜜蜂的分布范圍逐漸縮小，主要飼養在山區。目前，中國共有飼養蜂群820萬群，其中三分之二為西方蜜蜂。東、西方蜜蜂是我國的兩大主要飼養蜂種，追花奪蜜、轉地放蜂的飼養方式使得兩蜂種間的接觸十分密切，同地飼養更是為疾病在不同蜂種間的傳播創造了條件。西方蜜蜂是多種病毒的感染對象，近年來在國際范圍內得到較多關注［12-13］，對東方蜜蜂的病毒感染研究相對較少，主要集中于SBV［14-15］。對中國蜂群中蜜蜂病毒病的流行學調查研究近幾年剛剛開始，得到了一些不太一致的結果［11，16-17］，而關于我國主要飼養的蜂種東、西方蜜蜂病毒感染差異的報道更少。2012—2013年，作者從全國8省市37個蜂場收集東、西方蜜蜂共158群，進行7種常見病毒的檢測，分析兩個主要飼養蜂種之間的病毒感染差異情況，以期為我國蜜蜂的病毒發生特點以及蜜蜂資源的保護利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2012—2013年從我國8個省市37個蜂場收集樣品，其中包括23個西方蜜蜂蜂場及14個東方蜜蜂蜂場，樣品采集地分為西方蜜蜂與東方蜜蜂混養區、西方蜜蜂單獨飼養區以及東方蜜蜂單獨飼養區3種類型。每個蜂群收集100只左右的工蜂，放于飼喂盒中帶回實驗室，-80℃保存備用。樣品信息見表1。

1.2 主要試劑和儀器

RNA提取袋購于瑞士Bioreba AG公司，RNA提取試劑盒RNeasy Plant Mini Kit購自QIAGEN公司，熒光定量PCR試劑盒iScriptTMOne-Step RT-PCR Kit with SYBR?Green購自Bio-Rad公司。QIAGEN的QiaCube核酸純化儀，Nanodrop公司的ND-1000紫外分光光度計，Bio-Rad的iQ5TM熒光定量PCR儀。試驗所用引物均由上海英駿生物技術有限公司合成，引物序列參考B.Locke等的報道［18］。

表1 東方蜜蜂及西方蜜蜂樣品來源Table 1 Source of Apis cerana and Apis mellifera

1.3 樣品總RNA提取

從每群各取32只工蜂，放入提取袋中，間隔浸入液氮中用研磨棒磨碎，加入5 m L超純水，混合均勻后吸取100μL液體加入到350μL的RLT buffer中，使用RNeasy Plant Mini Kit試劑盒中相關試劑及QiaCube提取RNA。提取的RNA溶于60μL RNase-free水中，使用Nanodrop ND-1000檢測RNA的質量及濃度，-80℃保存備用。

1.4 RT-PCR檢測樣品中病毒

使用染病樣品提取的RNA以及相關引物進行RT-PCR擴增相應的病毒片段，PCR產物經純化后與p GEM-T Easy Vector（Promega）連接，轉化到大腸桿菌JM109中，培養陽性克隆并提取質粒，純化后-20℃保存，作為陽性對照備用。一步法RTPCR使用20μL反應體系：10μL 2×SYBR?Green RT-PCR Reaction Mix，正反向引物各0.4μL（10 μmol·L-1），0.3μL iScript Reverse Transcriptase，2μL RNA模板。每次RT-PCR反應都包含一個以質粒標準品為模板的陽性對照及一個以水為模板的陰性對照。反應條件：50℃10 min；95℃5 min；95℃10 s、58℃30 s，40個循環。同時收集熔解曲線（95℃1 min；55℃1 min；55℃升到95℃，80個循環，每個循環升高0.5℃），進行擴增產物的特異性確定。

2 結 果

2.1 不同蜂種的病毒感染情況

在東方蜜蜂及西方蜜蜂中，均檢測到6種病毒：DWV、BQCV、SBV、CBPV、ABPV及IAPV，均未檢出KBV。其中BQCV（感染率分別為100%及97.2%）為最流行的病毒，其次為DWV（78.0%與76.9%）。與東方蜜蜂相比，SBV對西方蜜蜂的感染明顯較多（P＜0.01）。CBPV、ABPV及IAPV對兩種蜜蜂的感染率均較低，分別為6.0%、4.0%、10.0%和9.3%、6.5%、27.8%（表2）。

表2 6種病毒在東方蜜蜂及西方蜜蜂中的感染率Table 2 Infection rate of six viruses in Apis cerana and Apis mellifera %

2.2 不同地區蜜蜂的病毒感染情況

由圖1可以看出，對于東、西方兩個蜂種，除了DWV在新疆西方蜜蜂中的感染率（44.4%）稍低之外，DWV及BQCV在8個取樣省市都普遍存在，特別是BQCV，感染率均超過66.7%。東方蜜蜂的4個取樣地：SBV在海南、福建和遼寧檢測到，感染率均低于31.6%；CBPV只在福建和遼寧發現，感染率分別為11.1%與10.5%；ABPV只在廣東樣品中檢測到，感染率為22.2%；IAPV在海南和遼寧檢測到陽性樣品，在海南的感染率（30.8%）高于遼寧（5.3%）。4個取樣省份中，在廣東檢測到3種病毒，海南及福建檢測到4種，而在遼寧則檢測到5種病毒。西方蜜蜂的7個取樣省市：DWV、BQCV以及SBV在7個取樣地均有發現，但SBV在福建的感染率（11.1%）極顯著低于其他地點（P＜0.01）；CBPV在北京、遼寧和福建均檢出陽性樣品；ABPV只在新疆檢測到，感染率為25.9%；除福建之外，IAPV在其他6個取樣地均檢出，在海南的感染率（61.5%）顯著高于其他各地（P＜0.05）。7個取樣省市中，在新疆、北京和遼寧均檢測到5種病毒，而在山西、山東、海南和福建則檢出4種病毒。

圖1 不同樣品采集地蜜蜂中6種病毒的感染率Fig.1 Infection rate of six viruses in different sample collection locations

2.3 不同類型飼養區蜜蜂的病毒感染情況

由表3看出，在西方蜜蜂飼養區檢測到6種病毒，東、西方蜜蜂混養區檢測到5種病毒，而在東方蜜蜂飼養區只檢測到3種病毒。DWV與BQCV是3種類型飼養區中最為流行的兩種病毒。SBV在西方蜜蜂飼養區的感染率為83.9%，而在東方蜜蜂飼養區未檢測到陽性樣品。在東、西方蜜蜂混養區未檢測到ABPV，檢測到的5種病毒中，DWV與BQCV在兩個蜂種中的感染率相差不大，SBV、CBPV及IAPV在東方蜜蜂中的感染率均低于西方蜜蜂，其中SBV與IAPV感染率差異顯著（P＜0.05）。在東方蜜蜂飼養區只檢測到3種病毒：DWV、BQCV及ABPV，與DWV和BQCV相比，ABPV的感染率較低，為22.2%。

表3 不同類型飼養區蜜蜂中6種病毒的感染率Table 3 Infection rate of six viruses in different beekeeping areas %

2.4 病毒的混合感染情況

如圖2所示，在東、西方兩種蜜蜂中都普遍存在多種病毒的混合感染現象。在西方蜜蜂中，只有一個蜂群未檢測到任何病毒，DWV或BQCV單個病毒感染的樣品只占1.9%和3.7%，其余樣品均被兩種或多種病毒混合感染，其中受DWV、BQCV與 SBV三種病毒或DWV、BQCV、SBV及IAPV四種病毒共同感染的樣品較多，占到樣品總數的34.3%和15.7%。在東方蜜蜂中，BQCV單個病毒感染的樣品占10.0%，受DWV與BQCV兩個病毒共同感染的樣品較多（52%），其余樣品均受兩種、三種或四種病毒混合感染。

圖2 西方蜜蜂和東方蜜蜂的病毒混合感染情況Fig 2 Multiple-viruses infection in Apis mellifera and Apis cerana

3 討 論

關于蜜蜂群病毒的流行情況，國內外對西方蜜蜂的研究較多，其中DWV與BQCV是感染西方蜜蜂的主要病毒［19-20］。對韓國的東方蜜蜂檢測后發現，BQCV的感染率最高，其次為SBV，而DWV、KBV及CBPV的感染率較低［21］。之前對中國蜜蜂進行的病毒學流行情況調查結果并不一致，J.L.LI等在東方蜜蜂中只檢測到ABPV、CBPV、BQCV、DWV、KBV及SBV六種病毒中的DWV與BQCV［16］；而H.X.AI等對中國的西方蜜蜂和東方蜜蜂進行病毒檢測時發現DWV是西方蜜蜂最為流行的病毒，其次為BQCV、SBV、IAPV、CBPV、ABPV，東方蜜蜂的情況有所不同，SBV是其感染率最高的病毒，其次為DWV，而IAPV、CBPV與BQCV的感染率稍低［11］。B.YANG等在調查中國東、西方蜜蜂病原菌的發生情況時檢測到BQCV、CBPV、DWV、IAPV及SBV五種病毒，其中DWV是最為流行的病毒（90%）［17］。與之前的結果一致，本研究未發現感染KBV的樣品，不同的是，本試驗在東、西方蜜蜂中均檢測到6種病毒：DWV、BQCV、SBV、CBPV、ABPV及IAPV，BQCV是兩蜂種中最為流行的病毒（感染率為100.0%與97.2%），其次為DWV、SBV、IAPV、CBPV與ABPV。上述研究結果的差異可能與樣品數量、樣品分布區域以及檢測方法的不同有關。研究顯示大、小蜂螨均可作為DWV載體，而西方蜜蜂經常被大、小蜂螨寄生危害，所以可推測西方蜜蜂感染DWV的可能性更大，雖然本研究顯示DWV對東、西方蜜蜂的感染率無明顯差異（78.0%與76.9%），但很可能受感染的西方蜜蜂中DWV的病毒量更高。

不同地區蜜蜂的病毒感染結果顯示，6種病毒在不同取樣地的分布不同，同種病毒在不同地區的發生率也不同。J.L.LI等研究中國的東方蜜蜂時發現，在19個取樣地中，在6個省份檢測到BQCV，而DWV只在3個省份檢測到，DWV在福建的感染率高達92%，而在四川的感染率只有33%，BQCV在甘肅的感染率為98%，而在河南的發生率則低至12%［16］。而本研究結果顯示，DWV對東方蜜蜂的感染率均高于63.2%，BQCV在各地的感染率為100%，這種感染率的差異應該與取樣地及感染率計算方法相關，J.L.LI等的感染率是基于蜜蜂個體計算［16］的，而本試驗中的感染率是以蜂群為單位進行的。各取樣地區檢測到的病毒種類與病毒數量有所差別，暗示著轉地放蜂以及不同地區間的蜂種交換會促進蜜蜂病毒的傳播，使其對蜜蜂的感染更加普遍。

病毒在不同類型飼養區蜜蜂中的分布顯示，東方蜜蜂單獨飼養區感染的病毒種類（3種病毒）少于東、西方蜜蜂混養區（5種病毒）及西方蜜蜂飼養區（6種病毒），說明東、西方蜜蜂混養可能促進病毒從西方蜜蜂傳向東方蜜蜂，但本研究從東方蜜蜂飼養區收集的樣品較少，應進一步擴大樣品數量，驗證此結果。在東、西方蜜蜂混養區，兩種蜜蜂對同種病毒的感染率不同，暗示病毒與寄主之間的互作關系可能存在差異。本研究結果顯示，西方蜜蜂感染SBV的比例明顯高于東方蜜蜂（74.1%與22.0%），即使在重發病區遼寧，東、西方蜜蜂近距離飼養，但SBV在西方蜜蜂中的發生率（63.5%）仍然高于東方蜜蜂（26.8%），但在實際養蜂業中SBV對東方蜜蜂的危害遠遠大于西方蜜蜂，驗證了不同寄主的SBV具有種間屏障、沒有交叉感染性的結論［22-23］。為了更好地監測和預防SBV，對兩種寄主的SBV的分子生物學特性、相關性和進化關系尚需要進一步研究。IAPV、ABPV與KBV的親緣關系較近，在西方蜜蜂中分布較為普遍，2009年X.YAN等報道在中國西方蜜蜂中檢測到IAPV［24］，2012年H.X.AI等在中國東方蜜蜂中發現IAPV［11］，本研究在西方蜜蜂飼養區及東、西方蜜蜂混養區均發現IAPV，而東方蜜蜂飼養區未檢測到此病毒，說明IAPV有可能由西方蜜蜂傳向東方蜜蜂。已有研究發現，ABPV可感染西方蜜蜂和熊蜂，并有人推測ABPV的原始寄主可能是西方蜜蜂，雖然目前尚未在其他國家的東方蜜蜂中發現ABPV，但本研究在東、西方蜜蜂單獨飼養區均檢測到該病毒，所以關于ABPV的原始寄主還需要進一步的驗證。KBV已經在克什米爾、印度、韓國的東方蜜蜂以及多個國家的西方蜜蜂中檢測到，但目前為止尚未在中國發現。

研究結果顯示，病毒的混合感染普遍存在于東、西方蜜蜂中，這與之前H.X.AI等對中國蜜蜂［11］以及Y.KOJIMA等［22］對日本蜜蜂的研究結果一致，他們都發現西方蜜蜂有高達4種病毒、東方蜜蜂有高達3種病毒混合感染。而本試驗在西方蜜蜂中檢測到5種病毒、在東方蜜蜂中檢測到4種病毒混合感染的存在，與之前的研究結果相比，混合感染的病毒數量更多，并且受多種病毒同時感染的樣品比例更高，說明我國蜜蜂病毒病的感染較為嚴重。

4 結 論

利用RT-PCR對2012—2013年從我國8個省市37個蜂場收集的東、西方蜜蜂進行7種病毒的檢測，發現兩個蜂種均被6種病毒感染，其中BQCV為最流行的病毒，其次為DWV。6種病毒在不同采樣地的分布及感染水平不同，不同類型飼養區蜜蜂的病毒感染也存在差異，但普遍存在多種病毒的混合感染。

致謝 對瑞典農業科學大學Eva Forsgren博士在試驗過程中提供的技術指導以及廣東省昆蟲研究所羅岳雄、張學鋒，遼寧省畜牧獸醫局張大利、袁春穎，北京市門頭溝雁翅鎮蜂場

付興萬在樣品采集過程中提供的幫助一并表示感謝。

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