PI3K／Akt抑制劑對雞朊蛋白過表達DF-1細胞增殖、侵襲和凋亡的影響

萬學瑞，朱曼玲，楊潤霞，劉桂林，劉 磊，吳 潤

（甘肅農業大學動物醫學院，蘭州730070）

PI3K／Akt信號轉導通路廣泛存在于細胞中，Akt是此通路中的一個關鍵分子，活性主要由PI3K的產物調控。胞外信號可以通過激活受體酪氨酸激酶（RTK）或G蛋白偶聯受體而激活PI3K，其產物使Akt磷酸化，p-Akt可在細胞質或細胞核內磷酸化多種蛋白質分子，通過改變下游分子的磷酸化狀態參與細胞的生長、增殖和存活。PI3K／Akt信號轉導通路是抑制細胞凋亡，促進細胞生長增殖的重要因素，使細胞維持周期運行［1］。渥曼青霉素（wortmannin，WM）是絲狀真菌繩狀青霉（Penicillium funiculosum）的代謝產物，可特異性、不可逆的抑制PI3K活性，阻斷PI3K／Akt信號通路。

細胞型朊蛋白（cellular prion protein，Pr PC）是由細胞自身基因編碼，普遍表達在真核細胞膜上的GPI錨定蛋白［2］。哺乳動物細胞型朊蛋白錯誤折疊形成異常癢病型朊蛋白（scrapie prion protein，Pr PSC）可致傳染性海綿狀腦病，但在非哺乳動物體內卻未見發病［3］。多項研究已證明哺乳動物細胞型朊蛋白具有多種生理功能，參與調節細胞增殖、分化、凋亡、侵襲、黏附、信號轉導、銅離子代謝和氧化應激等過程［4-10］，但具體機制還不清楚。本課題組前期的研究發現雞細胞型朊蛋白（ChPr PC）表達及分布規律同哺乳動物Pr PC相似［11］，通過構建雞細胞型朊蛋白過表達的雞成纖維（DF-1）穩定細胞系（DF-1-PrP）證實其可促進DF-1細胞黏附、增殖和侵襲，抑制其凋亡［12］，進一步應用實時熒光定量PCR檢測發現雞細胞型朊蛋白過表達DF-1細胞的Akt基因表達量明顯高于DF-1細胞，推測雞細胞型朊蛋白可能參與Akt的激活，進而促進細胞生長與抑制細胞凋亡［13］。為了證實這一推測，本研究擬利用渥曼青霉素阻斷PI3K／Akt信號通路，探討其對雞細胞型朊蛋白過表達DF-1細胞黏附、增殖、侵襲和凋亡的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 DF-1細胞、DF-1-Pr P細胞（Ch Pr PC過表達DF-1細胞）和DF-1-NC細胞（導入空表達載體pCDNA3.1的DF-1細胞），均由本實驗室保存或構建。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清（FBS，Hy Clone公司），鼠尾膠原（杭州生友生物技術有限公司）；G418、DMEM、無血清培養基（GIBCO公司），渥曼青霉素（Alexis公司），噻唑藍（MTT）、臺盼藍（上海酶聯生化試劑有限公司），Annexin V-FICT／PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒（上海貝博生物公司），Transwell小室（Costar公司），牛血清白蛋白（BSA，西安依科生物技術有限公司），其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 主要儀器 MyCyclerTMThermal Cycler EN-61010 PCR儀（美國BIO-RDA公司），Light Cycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀（美國Roche公司）；酶標儀680（美國BIO-RAD公司），FACSCalibur flow cytometer（美國BD公司）等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 DF-1-PrP、DF-1-NC和DF-1細胞用含10%胎牛血清、青霉素（100 U·m L-1）和鏈霉素（100 U·m L-1）的DMEM培養基置于37℃、5%CO2培養箱培養，當培養瓶中的細胞覆蓋率達到80%以上時，0.25%胰蛋白酶消化傳代，傳3代穩定后進行后續試驗。

1.2.2 黏附試驗 將鼠尾膠原用6 mmol·L-1無菌乙酸配制成6.25 mg·L-1的溶液，50 μL·孔-1加入96孔培養板，4℃過夜制備基底膜，吸出孔中殘余液體，加入50μL無血清培養基37℃孵育30 min水化基底膜。將對數生長期的DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1細胞，胰蛋白酶消化后，用培養液重懸細胞，調整細胞數為1×105·m L-1，100 μL·孔-1分別接種于包被鼠尾膠原的孔中，再加入渥曼青霉素使其終濃度分別為0、10、20、50、100、200 nmol·L-1，每組4個重復，37℃5%CO2環境下培養細胞，以包被牛血清白蛋白（BSA）為對照。細胞培養1 h后，用PBS溶液小心的洗細胞3次，按照MTT比色法測定培養板各孔的光吸收值（A值），試驗重復3次。應用如下公式分別計算各組細胞的黏附率：黏附率（%）＝［（處理組A值／BSA對照組A值）-1］×100%。

1.2.3 侵襲試驗 用6.25 mg·L-1鼠尾膠原溶液包被Transwell小室，4℃過夜風干，吸出殘余液體，加入50μL無血清培養基，37℃孵育30 min。用0.25%的胰蛋白酶消化處于對數生長期的DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1細胞，無血清培養液重懸細胞（1×105·m L-1）。在下室中加入400μL按1∶1混合的完全培養液和條件培養液（DF-1細胞生長至80%以上融合，換無血清培養液培養24 h后收集培養上清液，過濾除菌），上室中加入100μL細胞懸液，再加入渥曼青霉素使其終濃度分別為0、10、20、50、100、200 nmol·L-1，每組4個重復，37℃5%的CO2環境中培養24 h后，棄培養基，擦凈上室細胞，取出Transwell用PBS洗2次，95%的乙醇溶液固定細胞15 min，風干；加4 g·L-1的臺盼藍溶液染色20 min，PBS洗3次，倒置顯微鏡下隨機計數10個視野的細胞，取平均數，試驗重復3次。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖 取對數生長期的DF-1-PrP、DF-1-NC和DF-1細胞（1× 105·m L-1），100μL·孔-1接種96孔培養板中，加入渥曼青霉素使其終濃度分別為0、10、20、50、100、200 nmol·L-1，以DMEM培養液為空白對照，每組3個重復。細胞培養12、24、36、48、60 h后，每孔加入20μL MTT（5 mg·m L-1）溶液，置于CO2培養箱中孵育4 h后吸出孔內液體，再加入150μL DMSO振蕩10 min。用酶標儀檢測，讀取OD490nm處的吸光值。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 在對數生長期的DF-1-PrP、DF-1-NC和DF-1細胞中加入渥曼青霉素使其終濃度分別為0、10、20、50、100、200 nmol·L-1，作用24 h后，消化收集細胞（1× 107·m L-1），按Annexin V-FICT／PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，冷PBS洗細胞2次，加入200μL結合緩沖液重懸細胞，再加入10 μL Annexin V-FITC和5μL PI，輕搖混勻，孵育15 min；上述溶液中加入300μL結合緩沖液充分混勻，立即進行流式細胞儀檢測。

1.2.6 不同渥曼青霉素濃度下PRNP基因的轉錄量檢測 在對數生長期的DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1細胞中加入渥曼青霉素使其終濃度分別為0、10、20、50、100 nmol·L-1，作用24 h后，收集細胞提取總RNA。利用本實驗室建立的雞PrPC基因mRNA定量RT-PCR檢測方法，檢測PRNP基因mRNA表達量［13］。

1.2.7 統計學分析 采用SPSS17.0軟件One-Way分析（Anova）或t檢驗進行統計學處理，數據以±s表示，P＜0.05，P＜0.01為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 渥曼青霉素以劑量依賴方式抑制DF-1-PrP細胞黏附

細胞黏附試驗結果如表1所示，渥曼青霉素濃度為0 nmol·L-1時，各細胞黏附率均最高，且DF-1-Pr P細胞黏附率比DF-1-NC細胞和DF-1細胞分別高26.04%和26.18%，差異極顯著（P＜0.01），隨著渥曼青霉素濃度的升高，各細胞的黏附率均顯著下降。渥曼青霉素濃度10～50 nmol·L-1時，DF-1-Pr P細胞黏附率極顯著（P＜0.01）高于DF-1和DF-1-NC細胞；100 nmol·L-1時，DF-1-Pr P細胞黏附率顯著（P＜0.05）高于DF-1和DF-1-NC細胞；渥曼青霉素濃度達到200 nmol·L-1時，DF-1-PrP、DF-1-NC和DF-1細胞的黏附率無顯著差異；當渥曼青霉素濃度200 nmol·L-1時，3種細胞的黏附率分別被抑制了87.46%、72.65%和84.32%。

2.2 渥曼青霉素以劑量依賴方式抑制DF-1-Pr P細胞侵襲

細胞侵襲試驗結果如表2所示，渥曼青霉素濃度為0 nmol·L-1時，各細胞的侵襲穿膜細胞數最多，其侵襲力最強，隨著渥曼青霉素濃度的升高，細胞的侵襲力顯著下降，但同一渥曼青霉素濃度下DF-1-Pr P細胞侵襲穿膜細胞數顯著高于DF-1-NC和DF-1細胞（P＜0.05或P＜0.01）。當渥曼青霉素濃度高于100 nmol·L-1時，DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1細胞均不見侵襲穿膜細胞。

表1 不同濃度渥曼青霉素對細胞黏附率的影響Table 1 Effects of different concentration wortmannin（WM）on cell adhesion rates %

表2 不同濃度渥曼青霉素對細胞侵襲（侵襲細胞數）的影響Table 2 Effects of different concentration wortmannin on cell invasion（Cell numbers of invasion）

2.3 渥曼青霉素以劑量和時間依賴方式抑制DF-1-Pr P細胞增殖

應用MTT法檢測細胞的增殖，結果顯示（圖1），不加渥曼青霉素時，DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1細胞增殖活性均高于其渥曼青霉素處理的增殖活性；隨著渥曼青霉素濃度的增加和作用時間的延長，增殖抑制作用明顯增強，呈現明顯的時效和量效關系。同時在渥曼青霉素濃度低于50 nmol·L-1時，DF-1-Pr P細胞具有抗渥曼青霉素的能力，與DF-1-NC和DF-1細胞相比有統計學差異（P＜0.01）；而當渥曼青霉素濃度大于50 nmol·L-1時其幾乎完全抑制了各細胞的增殖。

圖1 不同渥曼青霉素濃度對細胞增殖的影響Fig.1 Effects of different concentration wortmannin on cell proliferation

2.4 渥曼青霉素以劑量依賴方式促進DF-1-Pr P細胞凋亡

細胞經Annexin-V-FITC／PI雙染后流式細胞儀檢測，結果顯示（圖2），在無渥曼青霉素處理時，DF-1-Pr P細胞總凋亡率（5.96%）低于DF-1-NC細胞（10.27%）和DF-1細胞（13.85%）。隨著渥曼青霉素濃度的增加，各細胞的總凋亡率均升高，而且呈現一定的劑量效應關系；渥曼青霉素濃度低于20 nmol·L-1以下時，對各細胞的凋亡率影響較小，當渥曼青霉素濃度高于50 nmo·L-1時，渥曼青霉素濃度對各細胞的凋亡率影響非常大。在同一渥曼青霉素濃度下，DF-1-PrP細胞的凋亡率低于DF-1-NC和DF-1細胞；尤其渥曼青霉素濃度為100、200 nmol·L-1時，DF-1-NC和DF-1細胞幾乎全部凋亡，但DF-1-Pr P細胞仍有56.63%和15.54%的細胞存活，具有抗渥曼青霉素的能力。

圖2 不同濃度渥曼青霉素對細胞凋亡的影響Fig.2 Effects of different concentration wortmannin on cell apoptosis

2.5 不同渥曼青霉素濃度下PRNP基因的轉錄量分析

利用本實驗室建立的雞PRNP基因m RNA實時熒光定量RT-PCR檢測方法，檢測DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1細胞PRNP基因轉錄水平表達量，結果顯示（圖3），加入渥曼青霉素時各細胞PRNP基因的mRNA拷貝數均出現變化；隨著渥曼青霉素濃度的增加，PRNP基因的mRNA拷貝數呈現出下降的趨勢。在同一渥曼青霉素濃度下，DF-1-PrP細胞PRNP基因的mRNA拷貝數均顯著高于DF-1-NC和DF-1細胞。

圖3 不同濃度渥曼青霉素對PRNP基因mRNA拷貝數的影響Fig.3 Effects of different wortmannin concentration on mRNA copy number of PRNP

3 討 論

Akt的活性與抗細胞凋亡以及細胞生長、增殖和能量代謝有關。在腫瘤細胞中Akt的表達量較正常細胞高，有加速白血病細胞增殖和抑制細胞程序性死亡的作用［14］，激活Akt還可改變細胞遷移和侵襲，提高卵巢腫瘤細胞的侵襲能力［15］。敲除小鼠的PrPC基因可明顯降低p-Akt表達量，加劇腦缺血后的神經損傷［16］。Pr PC和p-Akt在胃癌組織中協同表達，p-Akt有可能在Pr PC介導的胃癌惡性表型中發揮作用［17］。但雞細胞型朊蛋白的生理功能及其機制還未見報道，為此作者構建了Ch Pr PC過表達的雞成纖維細胞系DF-1-Pr P及空載體細胞系DF-1-NC。本試驗中，作者應用PI3K／Akt抑制劑渥曼青霉素阻斷該信號通路，探討其對Pr PC介導的細胞增殖、黏附、侵襲和凋亡過程的影響。結果顯示，渥曼青霉素濃度為0 nmol·L-1時，DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1細胞的增殖、黏附、侵襲能力均最高，總凋亡率均最低；且DF-1-Pr P細胞增殖、黏附、侵襲能力均高于DF-1-NC細胞和DF-1細胞，而總凋亡率卻低于DF-1-NC細胞和DF-1細胞，差異顯著（P＜0.05），說明ChPrPC的過量表達可促進DF-1-Pr P細胞增殖、黏附、侵襲，抑制其凋亡，這和PrPC在哺乳動物中的功能相似［7］。隨著渥曼青霉素濃度的增加，DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1細胞各自的PRNP基因mRNA表達量均減少，其增殖、黏附、侵襲能力相應下降，而總凋亡率均升高，且呈現一定的劑量效應關系，這證實了文獻報道的PI3K／Akt信號轉導通路是調節細胞存活最重要的途徑之一［18］，ChPrPC至少部分是通過PI3K／Akt信號通路對DF-1細胞的增殖、黏附、侵襲和凋亡進行調節的。但在低于100 nmol·L-1的同一渥曼青霉素濃度下，DF-1-Pr P細胞增殖、黏附、侵襲能力始終高于DF-1-NC細胞和DF-1細胞，而總凋亡率均低于DF-1-NC細胞和DF-1細胞，差異顯著（P＜0.05），說明ChPrPC的過量表達具有抗渥曼青霉素的能力。尤其在流式細胞術檢測細胞凋亡的試驗中，渥曼青霉素濃度為100和200 nmol·L-1時，DF-1-NC和DF-1細胞幾乎全部凋亡，但DF-1-Pr P細胞仍有56.63%和15.54%的細胞存活，提示ChPrPC還可通過其他途徑調節DF-1細胞的凋亡。

T.W.Poh等研究渥曼青霉素對PI3K／Akt信號通路的作用，結果表明渥曼青霉素能負調控PI3K／Akt信號通路中的多種分子，包括PI3K和m TOR，使Akt去磷酸化從而下調Akt激酶活性［18-19］。作者采用實時熒光定量RT-PCR法檢測發現，隨著渥曼青霉素濃度的增加，DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1細胞中PRNP基因mRNA表達量均減少，而在同一渥曼青霉素濃度下，DF-1-Pr P細胞中PRNP基因mRNA表達量均高于DF-1-NC細胞和DF-1細胞，表明Akt基因表達量與PRNP基因表達量相關聯，Akt對PrPC可能存在反饋調節，但其機制尚不明確。

總之，ChPrPC的過量表達可促進DF-1細胞增殖、黏附和侵襲，抑制其凋亡；渥曼青霉素以劑量依賴方式抑制DF-1細胞中PRNP基因mRNA表達及其細胞的增殖、黏附和侵襲，誘導其凋亡，表明PI3K／Akt信號通路可能在Ch Pr PC介導DF-1細胞增殖、黏附、侵襲和凋亡過程中具有重要的作用。Ch Pr PC的過量表達可抗渥曼青霉素引起的細胞凋亡，提示PI3K／Akt信號通路并不是ChPrPC調節細胞凋亡的唯一途徑。本研究結果為進一步闡明ChPrPC生理功能的分子機制奠定基礎。

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