CD8α在雄性牦牛主要免疫器官的分布

張 倩，楊 琨，黃玉風，潘陽陽，余四九，何俊峰，劉鵬剛，崔 燕

（甘肅農業大學動物醫學院，蘭州730070）

牦牛（Bos grunniens）被譽為高原之舟，生活在海拔3 km以上的青藏高原，高寒、缺氧及強輻射是高原地區最主要的應激因子，應對這些生態壓力，牦牛機體免疫和健康狀況發揮至關重要的作用。流行病學調查表明，牦牛疫病主要為細菌性傳染病和寄生蟲病，呈散發性發生，治療后未形成流行［1-3］。牦牛具有較好的抗寒抗病能力，因此對其免疫器官研究具有特殊的意義和價值。胸腺為機體中樞免疫器官，是T淋巴細胞的發育、成熟的場所［4-5］。脾、淋巴結及血結為次級免疫器官，是T細胞免疫應答反應發生的場所［6-8］。本課題組前期對牦牛胸腺及脾的增齡性形態特征進行了初步研究［9-10］。有學者報道牦牛血結微細結構與脾更相似［11］，有關牦牛免疫器官內相關免疫活性分子及細胞仍未見報道。

CD8分子最初發現于鼠類［12］，是細胞毒性T細胞（CTL）重要的表面標記物，一般以二聚體形式：αα同型和αβ異型存在于細胞表面［13-14］。CD8分子通過α鏈可穩定CTL與靶細胞結合，參與CTL活化信號轉導和胸腺細胞陽性選擇過程，β鏈一般不直接參與CD8分子生物功能，而是輔助α鏈完成有效信號轉導的發生［15］。CD8α＋CTL通過其TCR識別靶細胞表面抗原肽-MHCI類分子復合物，介導人和動物機體抗胞內寄生菌、病毒、某些真菌感染以及抗腫瘤，具有CTL表位的疫苗能誘導機體產生有效的保護性免疫應答［16-17］。對生理條件下，牦牛以CD8α＋T淋巴細胞為主的T細胞亞群進行組織分布研究及定量檢測，將為揭示傳染病的致病與免疫機理以及研制安全高效疫苗提供重要的理論指導和評價依據。CD8分子在免疫器官的數量及分布研究主要集中在牛［18-19］、羊［20］、兔［21］、貓［22］、袋鼠［23］等動物，有關牦牛CD8分子研究未見報道。

本研究采用RT-PCR法克隆牦牛CD8α基因序列，通過實時熒光定量PCR、Western blot及免疫組織化學SP法對成年牦牛胸腺、脾、腸系膜淋巴和血結內CD8αm RNA及蛋白的表達進行分析，初步了解成年雄性牦牛的機體免疫狀態及其抵抗病原體（細菌、病毒及寄生蟲）的主動防御能力，以期為適時免疫、致病機理和疾病防治等研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年9月中旬在青海西寧屠宰場采集3歲成年健康雄性牦牛胸腺、脾、位于空腸的腸系膜淋巴結及血結，各5頭份。部分放入4%中性多聚甲醛，用于石蠟切片免疫組化。部分迅速放入液氮中過夜，次日移至-80℃冰柜中保存，以備下一步提取組織中的RNA和蛋白質。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 牦牛CD8α基因測序引物（yak CD8α）根據GenBank登錄的黃牛（Bos taurus，BC151259.1）、印度水牛（Bubalus bubalis，XM＿006074749.1）、藏羚羊（Pantholops hodgsonii，XM＿005954881.1）、綿羊（Ovis aries，XM＿004007263.1），用Primer Premier 5.0軟件設計，根據測序所得牦牛CD8α（KP030823.1）和牦牛β-actin（DQ838049）內參基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設計熒光定量引物，由TaKaRa公司合成（表1），序列分析使用NCBI中的BLAST［24］、MEGA5［25］和DNAman［26］軟件。

1.2.2 mRNA的提取，反轉錄cDNA及PCR擴增按照TRIzol（Invitrogen）總RNA抽提試劑說明書提取各免疫器官總RNA。根據Invitrogen公司的Super Script TMⅢFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR試劑盒說明書反轉錄成cDNA。PCR反應體系為20μL（模板1μL，上下游引物各0.5μL，Taq PCR Master Mix 10μL，無菌去離子水8μL。反應結束后，取10μL PCR產物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，紫外燈下觀察，凝膠成像系統采集圖像。DNA膠回收試劑盒（TaKaRa）回收PCR產物片段，回收產物送華大基因公司測序。

表1 PCR擴增引物和熒光定量PCR引物Table 1 PCR primers used in the RT-PCR and real-time RT-PCR

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測免疫器官內CD8α mRNA表達 使用羅氏熒光定量PCR Lightcycler 480儀器進行。定量PCR反應體系：SYBR Premax Taq（TaKaRa）10μL、上下游引物各0.5 μL、c DNA樣品1μL和滅菌超純水8μL。定量PCR反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性10 s，62℃退火10 s，72℃延伸15 s，共45個循環；95℃5 s，65℃1 min，40℃30 s。每個循環的退火及延伸階段采集熒光信號數據。擴增結束后，立即進行熔解曲線分析，系統自動分析數據后生成熔解曲線，以確定樣品擴增的特異性。根據熒光定量PCR給出的Ct值和標準曲線中的擴增效率計算出定量結果，所得結果采用定量分析軟件進行分析，目的基因與內參基因擴增效率接近，為100%±5%，熒光定量PCR表達量用2-ΔΔCt法進行分析［27］。每管樣品設4個重復。

1.2.4 Western blot方法檢測免疫器官內CD8α蛋白水平表達 采取的胸腺、脾、腸系膜淋巴結及血結組織在液氮中研磨后，按1 m L RIPA＋10μL PMSF·（100 mg）-1（Solarbio）的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），勻漿約30 min。4℃1 200 g離心5 min，收集上清，用BCA法測定蛋白的含量。調整蛋白濃度，按比例加入4×SDS上樣緩沖液（Solarbio），沸水煮約10 min，使蛋白變性。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔上樣量為10 μL，當蛋白跑至分離膠，電壓由80 V切換為100 V直至電泳結束。用300 m A的電流在4℃冰箱內電泳1～2 h，將蛋白轉至PVDF（Solarbio）膜。再以5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入一抗小鼠Anti-CD8（1／200）（MCA837GA，Ab D Serotec）及小鼠Anti-Actin（I-19，Santa Cruz）4℃孵育過夜，PBS洗后分別加入二抗羊抗鼠（sp-0024，Bioss）37℃孵育2 h。加入ECL曝光液（碧云天）顯色5～10 min觀察結果，以β-actin為內參照。通過ImageJ軟件分析WB條帶的灰度值，進而得出蛋白的相對表達量。

1.2.5 免疫組化方法檢測免疫器官內CD8α蛋白水平的表達 石蠟切片脫蠟至水，0.03%H2O2孵育10 min以封閉內源性過氧化物酶，按免疫組織化學SP法程序進行染色。一抗小鼠Anti-CD8（MCA837GA，Ab D Serotec）按1／50稀釋，4℃冰箱孵育過夜，二抗室溫孵育10 min，SABC復合物室溫孵育10 min（Solarbio）。以上各步驟之間均用0.01 mol·L-1PBS，p H 7.3洗3 min×3次。AEC顯色30 min，脫水，透明，中性樹膠封片。應用Olympus-71型光學顯微鏡觀察并照相。陰性對照用BSA取代一抗進行孵育，其余步驟、條件均相同。

1.2.6 統計分析 試驗組數據采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。使用SPSS 21.0統計軟件進行數據處理。全部數據均用“±SE”表示，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，P＞0.05為差異不顯著。

2 結 果

2.1 RT-PCR及實時熒光定量PCR

分別提取牦牛胸腺、脾、腸系膜淋巴結及血結組織總RNA。擴增得到包含CD8α編碼區序列的PCR產物長度為970 bp提交至GenBank（KP030823.1），CD8α熒光定量引物擴增產物長度為213 bp，內參β-actin熒光定量引物擴增產物長度為207 bp（圖1）。使用DNAman軟件分析可知牦牛CD8αm RNA的編碼區為13～741 bp，全長729 bp，編碼243個氨基酸。將牦牛CD8α蛋白與其他物種CD8α的氨基酸序列進行多重比對，顯示與黃牛（Bos taurus）同源性最高，為99.7%，與印度水牛（Bubalus bubalis）、藏羚羊（Pantholops hodgsonii）、山羊（Capra hircus）、綿羊（Ovis aries）、寬吻海豚（Tursiops truncatus）、野豬（Sus scrofa）、單峰駝（Camelus dromedarius）的同源性分別為96.9%、94.1%、92.3%、86.8%、80.6%、72.5%和71.6%（圖2，圖3）。

實時熒光定量PCR結果顯示：CD8αm RNA在牦牛胸腺、脾、腸系膜淋巴結及血結均有表達；且在胸腺相對表達量最高，分別是脾、血結及腸系膜淋巴結的6.13倍、8.23倍和40.71倍（P＜0.01）（圖4A）。

圖1 RT-PCR反應結果Fig.1 The results of RT-PCR

圖2 獨立元素法構建牦牛CD8α基因進化樹Fig.2 The phylogenetic tree of yak CD8αwas constructed by independent element method

圖3 牦牛CD8α蛋白與其他物種氨基酸序列的多重比對Fig.3 The multiple alignment of amino acid sequences of yak CD8αwith other species

2.2 Western blot結果

分別提取牦牛胸腺、脾、腸系膜淋巴結及血結總蛋白，調整各組蛋白濃度后進行Western blot。結果表明CD8蛋白在牦牛各淋巴組織均有表達，且在胸腺相對表達量最高，分別是脾、血結及腸系膜淋巴結的2.64倍、3.75倍和10.82倍（P＜0.01）（圖4B，4C）。

2.3 組織結構觀察及免疫組織化學結果

胸腺CD8＋細胞在皮質、髓質都有分布（圖5A）；脾CD8＋細胞主要分布在動脈周圍淋巴鞘和紅髓，脾小結周邊及內部也有部分陽性細胞（圖5B）；腸系膜淋巴結內，CD8＋細胞主要分布在淋巴小結周邊及髓質，淋巴小結內部有少量分布（圖5C）；血結內分布情況與腸系膜淋巴結類似，CD8＋細胞主要分布在淋巴小結周邊及髓質，淋巴小結內部有少量分布（圖5D）。

3 討 論

對牦牛CD8α序列測序結果顯示其編碼區全長為729 bp，編碼243個氨基酸。將所得序列與Gen-Bank中其他物種氨基酸序列進行多重比對，顯示牦牛與黃牛氨基酸序列同源性最高，其次為印度水牛、藏羚羊、山羊、綿羊、寬吻海豚、野豬，與單峰駝同源性最低。結果表明CD8α在同屬種動物間同源性較高，牦牛其他免疫蛋白是否也存在相似的同源性有待研究。

圖4 CD8αmRNA及蛋白在牦牛免疫器官的表達Fig.4 The expression of CD8αmRNA and protein in yak immune organs

實時熒光定量PCR結果和Western blot結果顯示，在牦牛胸腺、脾、腸系膜淋巴結及血結內，均有CD8αmRNA和蛋白的表達，說明在正常生理條件下，CD8α基因和蛋白廣泛表達于牦牛各免疫器官；CD8αm RNA和蛋白的相對表達量在牦牛胸腺中最高，脾、血結次之，腸系膜淋巴結最低，表明CD8α基因和蛋白的表達在牦牛各組織器官中存在差異，這與W.Zhang等［19］對周邊免疫器官研究結果相符，即CD8蛋白在脾表達量高于血結，腸系膜淋巴結最低。推測這種差異性可能由于胸腺是負責T淋巴細胞分化和成熟的中樞免疫器官，CD4-CD8-前T細胞從骨髓或肝臟進入胸腺皮質，進行陰性和陽性選擇，之后轉化為CD4＋CD8＋表型，最后約5%T細胞經過受體重排，轉化為成熟CD4＋或CD8＋T細胞，向血液及其他淋巴組織（如淋巴結、脾及黏膜相關淋巴組織）遷移［28］。因此，大量不成熟 的雙陽性CD4＋CD8＋及成熟單陽性CD8＋T淋巴細胞的共同存在，使胸腺細胞CD8表達量較高。另外，本研究結果顯示CD8αmRNA和蛋白在血結與脾表達量高于腸系膜淋巴結，這與前人對牛［19，29］、羊［30］的研究結果相似。這種差異可能由于脾和血結是分布在血液循環通路上的免疫器官，而淋巴結分布在淋巴循環通路上，T淋巴細胞表達不同的趨化因子及其受體。CD8αmRNA和蛋白在血結的表達量與脾極為相似，但顯著高于腸系膜淋巴結，另外，W.Zhang等學者研究表明，在血結內免疫分子CD4及MHC II的表達量均高于脾［19］，提示血結可能與脾和腸系膜淋巴結一樣，在細胞免疫方面發揮重要作用。

免疫組化試驗結果表明，在正常生理條件下，胸腺CD8＋細胞在皮質、髓質都有分布，這與前人的研究結果類似［18，23］。另外，在脾CD8＋細胞主要分布在動脈周圍淋巴鞘和紅髓髓索；腸系膜淋巴結內分布情況與血結類似，CD8＋細胞主要分布在淋巴小結周邊及髓質。這與前人對不同動物CD8＋細胞在次級免疫器官分布的研究結果相似［18，21，23］，即陽性細胞主要分布在T細胞依賴區：動脈周圍淋巴鞘及紅髓、淋巴結小結周邊及淋巴索。推測這些位置可能是抗原捕獲發生的主要部位，CD8＋T細胞主要在此執行殺傷病毒感染細胞和腫瘤細胞的特異性殺傷效應。另外，本研究還發現，少量CD8＋細胞分布在脾、腸系膜淋巴結及血結的生發中心，這與 W.Zhang［19］等及B.H.Thorp等［20］結論不一致，他們認為次級免疫器官的生發中心無CD8陽性表達，這個有爭議的結果可能與抗體特異性相關，也可能由于動物機體在應對不同外來抗原（寄生蟲、細菌及病毒）時所處的免疫狀態有差異而致。另外資料顯示，次級淋巴器官的淋巴濾泡內分布有一定數量樹突細胞，并且這種樹突細胞表面攜帶CD8標記物［31］，這與本研究的結果相似。

4 結 論

本研究結果顯示，CD8αm RNA及蛋白在雄性牦牛各免疫器官中均有表達，且在胸腺表達量最高，脾、血結次之，腸系膜淋巴結表達量最低（P＜0.01）。免疫組織化學結果顯示，CD8＋T細胞在胸腺皮質、髓質均有分布；在脾主要分布在動脈周圍淋巴鞘和紅髓髓索；在腸系膜淋巴結及血結內，則主要分布在淋巴小結周邊及髓索。以上結果提示，牦牛胸腺為CD8＋T細胞主要的輸出器官，其輸出量可能影響次級淋巴器官內T細胞含量；血結可能與淋巴結及脾一樣，在細胞免疫發揮同等重要的作用。這些數據將為牦牛免疫遺傳學和免疫生物學等相關研究奠定基礎。

圖5 CD8在牦牛免疫器官表達的免疫組織化學結果200×Fig.5 Immunohistochemistry of CD8 in yak immune organs 200×

（

）：

［1］ 姬秋梅.中國牦牛品種資源的研究進展［J］.自然資源學報，2001，16（6）：564-570.JI Q M.Advances in research of yak resources in China［J］.Journal of Natural Resources，2001，16（6）：564-570.（in Chinese）

［2］ 姚金桂.天祝白牦牛疫病調查報告［J］.中國牛業科學，2011，37（4）：72-73.YAO J G.Disease survey report on Tianzhu White yak［J］.China Cattle Science，2011，37（4）：72-73.（in Chinese）

［3］ 殷銘陽，周東輝，劉建枝，等.中國牦牛主要寄生蟲病流行現狀及防控策略［J］.中國畜牧獸醫，2014，41（5），227-230.YIN M Y，ZHOU D H，LIU J Z，et al.Prevalence of yak main parasitic diseases in China and Strategies for its control［J］.China Animal Husbandry ＆Veterinary Medicine，2014，41（5）：227-230.（in Chinese）

［4］ PEARSE G.Normal structure，function and histology of the thymus［J］.Toxicol Pathol，2006，34（5）：504-514.

［5］ SAFIEDDINE N，KESHAVJEE S.Anatomy of the thymus gland［J］.Thorac Surg Clin，2011，21：191.

［6］ CESTA M F.Normal structure，function，and histology of the spleen［J］.Toxicol Pathol，2006，34（5）：455-465.

［7］ ZIDAN M，PABST R.Histology and ultrastructure of the lymph nodes of the buffalo（Bos bubalus）［J］.Anat Histol Embryol，2015，44：161-167.

［8］ ZIDAN M，PABST R.Histology of hemal nodes of the water buffalo（Bos bubalus）［J］.Cell Tissue Res， 2010，340：491-496.

［9］ 張 倩，余四九，崔 燕，等.牦牛胸腺增齡性變化的形態學觀察［J］.畜牧獸醫學報，2013，44（8），1305-1310.ZHANG Q，YU S J，CUI Y，et al.Morphologycal observation of age-associated changes in the thymus of the yak［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2013，44（8）：1305-1310.（in Chinese）

［10］ 康新華，崔 燕，賀延玉.高原牦牛脾的組織結構特點［J］.畜牧獸醫學報，2014，45（7）：1170-1174.KANG X H，CUI Y，HE Y Y.Characteristics of spleen structure in plateau yak［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2014，45（7）：1170-1174.（in Chinese）

［11］ 董曼靄，張愛琴.牦牛血結組織結構的研究［J］.中國獸醫科技，1989，12：15-16.DONG M A，ZHANG A Q.The histology study of yak haemal nodes［J］.Chinese Journal of Veterinary Science and Technology，1989，12：15-16.（in Chinese）

［12］ CANTOR H，BOYSE E A.Functional subclasses of T-lymphocytes bearing different Ly antigens.I.The generation of functionally distinct T-cell subclasses is a differentiative process independent of antigen［J］.J Exp Med，1975，141：1376-1389.

［13］ LEAHY D J.A structural view of CD4 and CD8［J］.FASEB J，1995，9（1）：17-25.

［14］ DUNCAN L G，NAIR S V，DEANE E M.The marsupial CD8 gene locus：molecular cloning and expression analysis of the alpha and beta sequences in the gray short-tailed opossum（Monodelphis domestica）and the tammar wallaby（Macropus eugenii）［J］.Vet Immunol Immunop，2009，129：14-27.

［15］ COLE D K，LAUGEL B，CLEMENT M，et al.The molecular determinants of CD8 co-receptor function［J］.Immunology，2012，137（2）：139-148.

［16］ LI Y，YIN Y，MARIUZZA R A.Structural and biophysical insights into the role of CD4 and CD8 in T cell activation［J］.Front Immunol，2013（4）：206.

［17］ SHRESTA S，PHAM C T，THOMAS D A，et al..How do cytotoxic lymphocytes kill their targets？［J］.Curr Opin Immunol，1998，10（5）：581-587.

［18］ MACHUGH N D，SOPP P.Bovine CD8（BoCD8）［J］.Vet Immunol Immunop，1991，27（1）：65-69.

［19］ ZHANG W，NASU T，HOSAKA Y Z，et al.Comparative studies on the distribution and population of immunocompetent cells in bovine hemal node，lymph node and spleen［J］.J Vet Med Sci，2012，74（4）：405-411.

［20］ THORP B H，SENEQUE S，STAUTE K，et al.Char-acterization and distribution of lymphocyte subsets in sheep hemal nodes［J］.Dev Comp Immunol，1991，15（4）：393-400.

［21］ JEKLOVA E，LEVA L，FALDYNA M.Lymphoid organ development in rabbits：major lymphocyte subsets［J］.Dev Comp Immunol，2007，31（6）：632-644.

［22］ BORTNICK S J，ORANDLE M S，PAPADI G P，et al.Lymphocyte subsets in neonatal and juvenile cats：comparison of blood and lymphoid tissues［J］.Comparate Med，1999，49（4）：395-400.

［23］ DUNCAN L G，NAIR S V，DEANE E M.Immunohistochemical localization of T-lymphocyte subsets in the developing lymphoid tissues of the tammar wallaby（Macropus eugenii）［J］.Dev Comp Immunol，2012，38（4）：475-486.

［24］ MCGINNIS S，MADDEN T L.BLAST：at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools［J］.Nucleic Acids Res，2004：32（Web Server issue），W20-25.

［25］ TAMURA K，PETERSON D，PETERSON N，et al.MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods［J］.Mol Biol Evol，2011，28：2731-2739.

［26］ WOFFELMAN C.DNAMAN for Windows［M］.Version 5.2.10：Lynon Biosoft，Institute of Molecular Plant Sciences，Leiden University，Netherlands，2004.

［27］ PFAFFL M W，HORGAN G W，DEMPFLE L.Relative expression software tool（REST）for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR［J］.Nucleic Acids Res，2002，30（9）：e36.

［28］ HALKIAS J，MELICHAR H J，TAYLOR K T，et al.Tracking migration during human T cell development［J］.Cellular Mol Life S，2014，71（16）：3101-3117.

［29］ WILSON R A，ZOLNAI A，RUDAS P，et al.T-cell subsets in blood and lymphoid tissues obtained from fetal calves，maturing calves，and adult bovine［J］.Vet Immunol Immunop，1996，53：49-60.

［30］ CARO M，GALLEGO M，BUENDIA A，et al..Postnatal evolution of lymphocyte subpopulations in peripheral blood and lymphoid organs in the goat［J］.Res Vet Sci，1998，65：145-148.

［31］ JESCHKE J C，WILLIAMS C B.Editorial：Crossing the divide：a novel Cd8 enhancer with activity in CTLs and CD8alpha＋dendritic cells［J］.J Leukocyte Biol，2015，97：623-625.