基于TiO2和CdTe熒光共振能量轉(zhuǎn)移的PDT體外滅活HL60細胞實驗研究

羅有煥，張　卿，陳　麗，艾保全，熊建文*

(1．廣東省高等學校量子信息技術(shù)重點實驗室， 華南師范大學物理與電信工程學院， 廣東 廣州510006；

2.廣東工業(yè)大學物理與光電工程學院， 廣東 廣州 510006)

基于TiO2和CdTe熒光共振能量轉(zhuǎn)移的PDT體外滅活HL60細胞實驗研究

羅有煥1，張卿1，陳麗2，艾保全1，熊建文1*

(1．廣東省高等學校量子信息技術(shù)重點實驗室， 華南師范大學物理與電信工程學院， 廣東 廣州510006；

2.廣東工業(yè)大學物理與光電工程學院， 廣東 廣州 510006)

摘要：為研究TiO2和CdTe量子點間熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率對PDT體外滅活HL60細胞的影響，本文以發(fā)射波長為407.8 nm的TiO2為供體，CdTe為受體，通過TiO2與CdTe超聲混合構(gòu)建熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系，研究了TiO2和CdTe量子點間熒光共振能量轉(zhuǎn)移；其中體系中TiO2濃度為200 μg/mL時，通過逐漸增加體系中CdTe濃度來觀察供體TiO2熒光強度變化，根據(jù)Forster能量共振轉(zhuǎn)移理論計算體系能量轉(zhuǎn)移效率。之后將體系用于PDT體外滅活HL60細胞的實驗研究，采用CCK- 8 法，結(jié)合酶聯(lián)免疫檢測儀進行細胞活性檢測，得出不同濃度下體系的PDT滅活效率。發(fā)現(xiàn)當TiO2-CdTe體系熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率20.21%時，PDT滅活效率為53.75%，而當體系能量轉(zhuǎn)移效率為6.77%時，滅活效率達到了71.54%，實驗表明在一定濃度范圍內(nèi)，TiO2-CdTe混合體系熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率低時，PDT滅活效率更高。這可能是由于TiO2-CdTe之間能量共振轉(zhuǎn)移低時，容易致使TiO2表面光生電子和空穴復合率降低，提高了二氧化鈦的光催化活性，導致滅活效率增高。

關(guān)鍵詞：TiO2-CdTe；共振能量轉(zhuǎn)移；光動力療法(PDT)；白血病HL60細胞

0引言

光動力療法(photo dynamic therapy，PDT)是借助光敏劑進入患者體內(nèi)后,動態(tài)濃集于生長異常的組織(如腫瘤、鮮紅斑痣及黃斑病變)，后者在一定波長光輻照下，因其所攝入光敏劑發(fā)生光動力敏化反應而產(chǎn)生活性氧物質(zhì)，導致生物大分子光氧化失活，并由此造成細胞器損傷而破壞目標組織以達到治療目的方法[1,2]。在光動力療法中，由于腫瘤等在人體中的深淺不一，使得傳統(tǒng)光敏劑的應用受到限制，而量子點由于其尺寸效應，使其吸收光譜能夠被調(diào)節(jié)去匹配深淺不同的腫瘤的需要[3,4]。量子點直接作為光敏劑或用于能量轉(zhuǎn)移提高傳統(tǒng)光敏劑的光動力療效已初見成效[5-6]。

熒光成像技術(shù)在現(xiàn)代生命科學中是一種非常重要的實驗研究手段。近年來生命科學領(lǐng)域出現(xiàn)了一種嶄新的技術(shù)：熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)，是一種通過熒光物質(zhì)間發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移進行分析的一種實驗方法。FRET是指在兩個不同的熒光基團中，若一個熒光基團(供體Donor)發(fā)射光譜與另一個基團(受體acceptor)的吸收光譜有一定的重疊，兩個熒光基團間的距離合適時(一般小于10 nm),即可觀察到熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。研究表明，量子點不僅可以作為FRET供體也可以作為受體[7-9]，利用這種技術(shù)能夠定時定量、定位、無損傷檢測細胞內(nèi)的分子相互作用[10-12]。

傳統(tǒng)PDT通過滅活實驗方法研究得出該光敏劑的最佳作用時間、光照強度、藥物濃度、藥物配比等，進而得出最佳PTD效率，但實驗操作周期長、繁瑣，不經(jīng)濟。本文將研究CdTe-TiO2混合體系的熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象及將其應用于PDT體外滅活HL60細胞實驗研究；通過體系的熒光光譜圖研究其熒光能量轉(zhuǎn)移規(guī)律，計算體系熒光共振能量轉(zhuǎn)移的效率，并將不同濃度比例的TiO2-CdTe體系用于PDT體外滅活HL60細胞，通過檢測細胞活性得出在不同濃度下體系的PDT滅活效率，探討CdTe-TiO2混合體系能量轉(zhuǎn)移效率與PDT滅活效率的關(guān)系，試圖從能量共振轉(zhuǎn)移的角度出發(fā)去尋求最佳作用藥物濃度配比，達到最佳PDT滅活效果。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

UV-1700紫外-可見光譜儀(日本 Shimadzu)，JEM-2100HR透射電子顯微鏡(日本 JEOL)，X射線粉末衍射儀(德國 Bruker)，WFY-28型熒光分光光度計(天津 拓普)，DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南矛華儀器有限公司)，SK2510LHC超聲儀(上海科導)，TiO2(P25，德國DEGUSSA)，碲粉，NaBH4 , 巰基丙酸，CdCl2，NaOH, 血清含量為 10%的完全RPMI-1640 培養(yǎng)基 (美國 GIBCO)，CCK-8 試劑 (日本同仁化學研究所)，5%臺盼藍細胞染色液(美國 Invitrogen)，無水乙醇，去離子水， CountessTM型自動細胞計數(shù)儀(美國 Invitrogen)，PDT 反應室(自行設計)，Bio-Rad 美國伯樂 imark 酶標儀，SW-CJ型潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù))，HH.CP-TW80 升二氧化碳培養(yǎng)箱(上海一恒科技)， MDF-192(N)型醫(yī)用低溫冰箱(日本三洋)，HC-2518高速離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司)，微量移液槍(芬蘭)，96 孔培養(yǎng)板，細胞計數(shù)板等其他常規(guī)器皿。

1.2實驗方法

1.2.1量子點的合成

參照Zhang H等[13]的方法并作適當調(diào)整，將碲粉和NaBH4分別倒入反應瓶中，注入適量水，磁力攪拌下進行反應半小時，反應過程中反應體系由氮氣脫氧保護，得NaHTe溶液。在氮氣飽和的CdCl2水溶液中加入巰基丙酸，用NaOH調(diào)溶液的PH在9.5左右，用強磁力攪拌半小時后加入NaHTe溶液，于95攝氏度下磁力攪拌回流2小時，整個實驗過程通氮氣保護，獲得CdTe水溶性量子點，之后再離心、干燥、研磨得到CdTe粉末。

1.2.2量子點表征

測量量子點CdTe 的吸收光譜；熒光發(fā)射光譜；X射線衍射圖；透射電鏡圖。

1.2.3混合體系CdTe-TiO2熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系的構(gòu)建

配比一定濃度的TiO2溶液，與不同濃度的CdTe混合，超聲混合半小時使其充分混合均勻，然后測定TiO2的熒光光譜。考慮到體系之后用于PDT體外滅活HL60細胞，根據(jù)實驗室以往的最佳數(shù)據(jù)研究，混合體系中TiO2的濃度設定為200 μg/mL，CdTe濃度分別為0 μg/mL 、0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、0.75 μg/mL、1 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL。同樣地固定CdTe濃度為25 μg/mL，與濃度為0.5 μg/mL、1 μg/mL、1.5 μg/mL、2 μg/mL的TiO2混合，超聲混合半小時后測量CdTe的熒光光譜變化。根據(jù)供體熒光強度變化來計算不同濃度混合體系下的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率。

1.2.4細胞培養(yǎng)

白血病 HL60 細胞采用胎牛血清含量為10 %的RPMI- 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)箱的相關(guān)參數(shù)設置如下:箱內(nèi)溫度為 37 ℃，箱內(nèi)空氣濕度為95%，CO2體積分數(shù)為5 %。當細胞進入對數(shù)生長期時，取一定量的細胞液，通過倍比稀釋法確定細胞濃度。

1.2.5細胞活性檢測

本文采用與傳統(tǒng)方法相比具有操作簡單、靈敏度高、可重復性好的 CCK- 8(cell counting Kit- 8)法[14, 15],結(jié)合DG5031型酶聯(lián)免疫檢測儀進行細胞活性檢測。為盡可能降低誤差，我們采用雙波長法進行檢測:以450 nm作為測量波長，630 nm作為參比波長檢測細胞活性的一般步驟為: (1)制備細胞懸液，(2)將細胞懸液加入96 孔培養(yǎng)板，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間，(3)加入適量的CCK-8試劑，置于37 ℃培養(yǎng)箱中遮光培養(yǎng)4小時，(4)測定吸光度(OD值)。

1.2.6混合體系CdTe-TiO2用于PDT體外滅活HL60的實驗設計

根據(jù)實驗內(nèi)容在96孔培養(yǎng)板進行規(guī)劃實驗，實驗分為光照板和遮光板，每個板分別設置調(diào)零組和實驗組。為盡減小實驗誤差，同一條件設置三個重復孔。取對數(shù)生長期的HL60細胞以細胞濃度為2×105個/mL接種在96孔板設定好的實驗組中，實驗組中的每孔接種體積為100 μL細胞，而在調(diào)零組中，只加入200 μL的血清含量為10%的完全RPMI-1640培養(yǎng)液，接著在實驗組中加入100 μL的光敏劑溶液，并使HL60細胞液和光敏劑溶液的混合液中光敏劑最終濃度和體系在測試能量共振轉(zhuǎn)移中的濃度一致，從而達到實驗要求。隨后，用振蕩器將混合液混合均勻，再用無水乙醇擦拭96孔培養(yǎng)板，然后將96孔培養(yǎng)板放入37 ℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，之后光照板在本實驗室自主研發(fā)的光動力反應室進行光照1 h，遮光板避光處理，接著將96孔培養(yǎng)板繼續(xù)放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間，之后每孔加入20 μL CCK-8試劑，混合均勻再放入二氧化碳培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)2個小時，最后使用 Bio-Rad美國伯樂imark酶標儀，以450納米為測量波長，630納米為參比波長，對上述實驗組和調(diào)零組進行活性檢測。

2實驗結(jié)果與討論

2.1量子點CdTe的表征

圖1　CdTe的吸收光譜Fig.1　Aborption spectra of CdTe

圖2　CdTe量子點的XRD圖Fig.2　XRD pattern of CdTe quantum dots

圖3　CdTe量子點的透射電鏡圖Fig.3　TEM image of CdTe QDs

圖1為CdTe的吸收光譜，可以看到量子點在478 nm處有吸收峰，且吸收范圍較寬。圖2為CdTe量子點的XRD圖，具有二個衍射峰，其中峰形明顯，并非尖鋒，符合小尺寸量子點的特點，峰位對應的角度分別是:24.38、40.31和47.02，分別對應于CdTe立方晶系的(111)、(220)、(311) 3個晶面,顯示了比較好的晶形結(jié)構(gòu)，屬于閃鋅礦立方晶相。利用本實驗的方法制得的CdTe在水溶液中具有良好的分散性與穩(wěn)定性，如圖3所示，所制備CdTe的TEM照片，CdTe近似球形，尺寸為3-5 nm之間，分散性較均勻，基本沒有團聚現(xiàn)象。圖4和圖5中的曲線1分別為CdTe和TiO2在激發(fā)波長為345 nm下的熒光光譜圖。

2.2CdTe-TiO2量子點間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移

從圖4曲線1中可以看到TiO2的熒光發(fā)射峰位于407.8 nm和470 nm處，而從圖1.CdTe量子點的吸收光譜中可以觀察到CdTe在400-500 nm之間有很強的吸收，若將TiO2作為供體，CdTe作為受體，即可觀察到供體的發(fā)射光譜和受體的吸收光譜有很好的光譜重疊，而供體的發(fā)射光譜(圖5中曲線1)和受體的發(fā)射光譜幾乎沒有重疊部分，發(fā)射光譜不會產(chǎn)生相互干擾，說明用該波長的TiO2作為供體與CdTe可以構(gòu)成熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系。

TiO2: 200 μg/mL ; CdTe(1-5): 0 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 75 μg/mL, 100 μg/mL圖4 　CdTe濃度對TiO2-CdTe體系能量轉(zhuǎn)移的影響Fig.4　Effect of CdTe concentration on energy transfer between TiO2 and CdTe

CdTe: 25 μg/mL ; TiO2 (1-5): 0 μg/mL, 0.5 μg/mL, 1 μg/mL, 1.5 μg/mL, 2 μg/mL圖5　TiO2濃度對TiO2-CdTe體系能量轉(zhuǎn)移的影響Fig.5　Effect of TiO2 concentration on energy transfer between TiO2 and CdTe

為了進一步研究TiO2-CdTe體系熒光共振能量轉(zhuǎn)移，將固定TiO2的濃度不變，逐漸增加CdTe的濃度，得到體系中TiO2的熒光光譜如圖4所示，隨著CdTe濃度的增加，TiO2的主要熒光發(fā)射峰(407.8 nm)峰值強度逐漸減弱；固定CdTe的濃度不變，逐漸增加TiO2的濃度，得到體系中的CdTe的熒光光譜如圖5所示，隨著TiO2的濃度逐漸增大，CdTe熒光峰強度逐漸增大，說明了TiO2-CdTe之間發(fā)生了有效的能量轉(zhuǎn)移。

2.3CdTe-TiO2體系PDT體外滅活HL60

2.3.1計算CdTe-TiO2熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率

考慮到CdTe中的鎘離子對細胞具有毒性[16, 17]，并結(jié)合本實驗室以往的實驗數(shù)據(jù)研究[18, 19]，本次PDT體外滅活HL60細胞實驗選用的濃度為：在CdTe-TiO2混合體系中，CdTe濃度的分別為0 μg/mL、 0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、0.75 μg/mL、1 μg/mL，TiO2的濃度為200 μg/mL，測試體系中TiO2的熒光光譜圖如圖6所示。

TiO2: 200 μg/mL ; CdTe(1-5): 0 μg/mL, 0.25 μg/mL, 0.5 μg/mL, 0.75 μg/mL, 1 μg/mL圖6　CdTe濃度對TiO2-CdTe體系能量轉(zhuǎn)移的影響Fig.6　Effect of CdTe concentration on energy transfer between TiO2 and CdTe

根據(jù)Forster熒光能量共振轉(zhuǎn)移理論(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET),其能量轉(zhuǎn)移效率E與給供-受體間的距離(r)以及臨界能量轉(zhuǎn)移距離(R0)有關(guān)，能量轉(zhuǎn)移效率E表達式為:

(1)

式中Fda是有受體時供體的熒光強度，F(xiàn)d為沒有受體時供體的熒光強度，n為每個供體分子周圍受體分子的數(shù)目，R0是能量轉(zhuǎn)移效率達到50%的距離，它依賴于供受體雙方的物理性質(zhì)以及它們的取向，可用公式表達為：

(2)

式中k2為偶極空間取向因子，n為溶劑的折射率，Φd為無受體存在時供體的熒光量子產(chǎn)率，J(λ)為供體的熒光發(fā)射光譜與受體的吸收光譜之間的重疊積分，即：

(3)

式中F(λ)為熒光供體在波長λ處的熒光強度，ε(λ)為受體在波長λ處的摩爾吸收系數(shù)，能量轉(zhuǎn)移效率可以式子(1)求出。根據(jù)式(1)可求出得到體系中CdTe濃度為0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、0.75 μg/ml、1 μg/mL的能量轉(zhuǎn)移效率分別為17.25%、20.21%、11.75%、6.77%。

2.3.2不同濃度的TiO2-CdTe體系PDT體外滅活HL60細胞實驗研究

利用CCK-8法測量在光照板和遮光板中，添加了不同濃度TiO2-CdTe后培養(yǎng)的HL60細胞的OD 值，測的實驗OD值如圖7所示:

圖7　混合體系TiO2-CdTe中不同CdTe濃度PDT對HL60細胞OD值的影響Fig.7　The influence of different CdTe concentration of TiO2-CdTe to OD values of HL60 cells base on PDT

光照后，各遮光組細胞的OD值均高于光照組細胞的OD值，滅活HL60 細胞的效率(PDT efficiency)用Pe表示：

(4)

其中，ODR表示光照后細胞的OD值，ODWR表示不光照時的細胞OD值。跟據(jù)式(4)可得到混合體系TiO2-CdTe中不同CdTe濃度的PDT滅活效率為59.70%；53.75%；59.02%；71.54%。

2.3.3量子點間能量轉(zhuǎn)移效率與PDT滅活效率存在的對應關(guān)系

根據(jù)A、B、C、D四組得出的能量轉(zhuǎn)移效率和PDT滅活效率參數(shù)，將其繪制成體系TiO2-CdTe共振能量轉(zhuǎn)移效率和PDT體外滅活效率的關(guān)系圖。如圖8所示，從圖中我們可以發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著體系能量共振轉(zhuǎn)移效率的降低，滅活效率有所增高，當體系TiO2-CdTe熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率20.21%時，PDT滅活效率為53.75%，而當體系能量轉(zhuǎn)移效率為6.77%時，滅活效率達到了71.54%。本次實驗表明在一定濃度范圍內(nèi)，TiO2-CdTe混合體系熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率低時，PDT滅活效率更高。

圖8　能量轉(zhuǎn)移效率與PDT滅活效率Fig.8　Energy transfer efficiency and PDT inactivated efficiency

3結(jié)論

本文用合成的CdTe與TiO2超聲混合，研究兩者之間的能量共振轉(zhuǎn)移，并將兩者的混合體系用于體外PDT滅活HL60細胞。研究表明量子點能夠使TiO2的吸收光譜拓寬，光能利用效率明顯增大[20-22]，光催化效率增高，我們此前實驗結(jié)果表明，TiO2-CdTe混合體系要比單純的TiO2滅活效率要高，這說明量子點CdTe加入有效的提高了TiO2的光催化活性。而本次實驗結(jié)果表明，當TiO2-CdTe之間能量共振轉(zhuǎn)移低時，PDT滅活效率增高。這可能是由于TiO2-CdTe之間能量共振轉(zhuǎn)移低時，容易致使TiO2表面光生電子和空穴復合率降低，從而提高了二氧化鈦的光催化活性，導致滅活效率增高。對于加入量子點后TiO2光催化活性的提高，PDT滅活效率提高的程度，我們可以從TiO2與CdTe能量共振轉(zhuǎn)移的角度去分析。事實上TiO2-CdTe體系對細胞的滅活機理較為復雜，為更清楚地了解其作用機理，更多的相關(guān)實驗研究是我們下一步的工作。總之，在尋求TiO2-CdTe體系PDT最佳作用濃度、配比的問題上，根據(jù)我們的實驗分析可以從TiO2-CdTe熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率方面入手，去尋求合適的藥物配比、濃度，以求達到最佳的滅活效果。

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Experimental Research on the PDT Vitro Inactivation of HL60 Cells Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer between

TiO2and CdTe Quantum DotsLUOYouhuan1,ZHANGQing1,CHENLi2,AIBaoquan1,XIONGJianwen1*

(1.Laboratory of Quantum Information, School of Physics and Telecommunication Engineering,South China Normal University, Guangzhou 510006, Guangdong, China; 2.School of Physics and Optoelectronic Engineering, Guangzhou 510006, Guangdong, China)

Abstract：A fluorescence resonance energy transfer system based on TiO2and CdTe ultrasonic mix was built to study how fluorescence resonance energy transfer between TiO2and CdTe quantum dots influence HL60 viability in PDT experiment. TiO2with 407.8 nm emission wavelength was used as donor, and CdTe as acceptor. The intensity change of donor TiO2was observed when the concentration of CdTe was increased in proportion, and the concentration of TiO2remained at 200 μg/mL. The system energy transfer efficiency was calculated according to the theory of Forster energy transfer. The system was then applied in in vitro PDT experiment based on HL60 cells. With CCK-8 method, the cell viability under different drug concentration was calculated. Our data showed that when the fluorescence resonance energy transfer efficiency of TiO2-CdTe hybrid system was 20.21%, the PDT inactivated efficiency was 53.75%; when the system energy transfer efficiency was 6.77%, the inactivated efficiency reached 71.54%. The results showed that low fluorescence resonance energy transfer efficiency promote higher PDT inactivation efficiency. This might be on account of the decrease of the recombination rate of electron-hole pair caused by the decline of fluorescence resonance energy transfer efficiency, which enhanced the photocatalytic activity of TiO2.

Key words：TiO2-CdTe; resonance energy transfer; photodynamic therapy(PDT); leukemic HL60 cell

文章編號：1007-7146(2015)06-0506-07

文獻標志碼：A

中圖分類號：R318.51

*通訊作者：熊建文(1962-)，男，廣東人，華南師范大學教授，博士，博士生導師，主要研究方向為激光生物學與生物醫(yī)學光子學。(電話)020- 85216860；(電子郵箱)jwxiong@scnu.edu.cn

作者簡介：羅有煥(1989-)，男，廣西陸川人，碩士研究生，主要研究方向為光電技術(shù)及應用研究。(電子郵箱)youhuanluo@126.com

基金項目：國家自然科學基金(61072029)；廣州市科技計劃資助項目(2014J4100049)

收稿日期：2015-09-16;修回日期:2015-10-13

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.06.003