N-乙酰半胱氨酸對兔肝缺血/再灌注損傷的保護作用

戴大軍 蔡俊贏

1.江西省德安縣中醫院麻醉科，江西德安 330400；2.南昌大學第二附屬醫院麻醉科，南昌 330000

肝缺血/再灌注損傷是肝臟外科手術中常見的病理過程，尤其是肝臟移植手術，嚴重者可導致肝功能衰竭[1]。肝缺血/再灌注損傷的病理機制尚未明確，目前認為是多種因素共同作用的結果，如中性粒細胞和Kupffer 細胞被激活、細胞內鈣超載[2]、氧自由基釋放[3]、一氧化氮和內皮素水平失衡[4]、肝細胞凋亡等。本研究探討N-乙酰半胱氨酸（NAC）清除氧自由基的作用[5-6]與缺血/再灌注損傷導致肝細胞凋亡之間的關系，揭示NAC 對肝缺血/再灌注損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成生物科技有限公司），總超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（南京建成生物科技有限公司），凱基原位末端標記法細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司），TKR-200C 小動物麻醉機（江西特力麻醉呼吸設備有限公司），全自動生化分析儀（日本Olympus-AU2700），飛利普G30 多功能監護儀。

1.2 實驗動物與分組

選擇周齡3～4 周，體重3.5～4.5 kg 的健康實驗兔40 只（南昌大學實驗動物科學部提供）。全部實驗兔術前均禁食8 h，禁飲4 h。將其隨機分為兩組：肝缺血/再灌注組（I/R 組）和肝缺血/再灌注+N-乙酰半胱氨酸組（I/R+NAC 組）。I/R 組肝缺血30 min 后再灌注7 h；I/R+NAC 組于再灌注前5 min 泵注NAC 150 mg/kg，再灌注7 h 后持續泵注NAC 10 mg/（kg·h），I/R 組同時泵注等容量0.9%氯化鈉[7]。兩組實驗兔在性別、周齡、體重、手術時間、出血量及輸液量等方面比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.3 模型制作

所有實驗兔先肌注氯胺酮13 mg/kg 基礎麻醉，待麻醉成功后用飛利普G30 多功能監護儀監測兔心電圖及血氧飽和度，并建立耳緣靜脈通路，隨后經靜脈注射丙泊酚（2～4 mg/kg），維庫溴銨（0.1～0.3 mg/kg）后行氣管插管，接小動物麻醉機控制呼吸（潮氣量=8 ml/kg，呼吸頻率=15 次/min），行右側股動脈穿刺置管測直接動脈壓。術中微量泵持續注入丙泊酚[1～3 mg/（kg·h）]，復合吸入異氟醚（1%～4%）維持麻醉。消毒鋪巾，采取上腹部正中切口，開腹后暴露肝門部，分離出門靜脈，用血管鉗夾閉以阻斷70%肝血流，30 min 后恢復血供[8]。

1.4 觀察指標

兩組分別在門靜脈阻斷前（T0）、門靜脈開放即刻（T1）、開放后2 h（T2）、開放后5 h（T3）、開放后7 h（T4）5 個時間點記錄心率（HR）、平均動脈壓（MAP），經股動脈采血2 ml，檢測血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、MDA、SOD 活性，其中ALT、AST 采用日本Olympus-AU2700 全自動生化分析儀檢測，MDA 用硫代巴比妥酸化學比色法檢測，SOD 用黃嘌呤氧化酶法檢測[9-10]。并取肝中葉，用10%甲醛浸泡固定，石臘包埋后切片，檢測凋亡肝細胞數（原位缺口末端標記法和瓊脂糖凝膠電泳法），在400倍光鏡下觀察每張切片，隨機計算5 個高倍鏡視野下的凋亡細胞數[11-13]。

1.5 統計學分析

采用統計軟件SPSS 16.0 對實驗數據進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t 檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組不同時點HR、MAP 的比較

兩組實驗兔T2、T3、T4時HR、MAP 均較T0、T1時明顯降低（P<0.05），但兩組組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）（表1）。

表1 兩組不同時點HR、MAP 的比較（±s，n=40）

表1 兩組不同時點HR、MAP 的比較（±s，n=40）

與同組T0時比較，aP<0.05；與同組T1時比較，bP<0.05

2.2 兩組不同時點ALT、AST 的比較

與T0時比較，兩組T1、T2、T3、T4各時間點ALT、AST顯著升高（P<0.05）；與I/R 組比較，I/R+NAC 組T1、T2、T3、T4時ALT、AST 明顯下降（P<0.05）（表2）。

表2 兩組不同時點ALT、AST 的比較（U/L，±s，n=40）

表2 兩組不同時點ALT、AST 的比較（U/L，±s，n=40）

與同組T0時比較，aP<0.05；與I/R 組同時點比較，bP<0.05

2.3 兩組不同時點MDA、SOD 的比較

與T0時比較，兩組T1、T2、T3、T4各時間點MDA 明顯升高（P<0.05），SOD 明顯降低（P<0.05）；與I/R 組比較，I/R+NAC 組T1、T2、T3、T4時MDA 明 顯 下 降（P<0.05），SOD 明顯升高（P<0.05）（表3）。

表3 兩組不同時點MDA、SOD 的比較（±s，n=40）

表3 兩組不同時點MDA、SOD 的比較（±s，n=40）

與同組T0時比較，aP<0.05；與I/R 組同時點比較，bP<0.05

2.4 兩組不同時點肝細胞凋亡數的比較

原位缺口末端標記法染色陽性表達在細胞核，呈深淺不一的棕黃色。T0、T1、T2時兩組間凋亡細胞數差異無統計學意義（P>0.05）；I/R+NAC 組T3、T4時凋亡細胞數較I/R 組明顯降低（P<0.05）（表4）。

表4 兩組不同時點肝細胞凋亡數的比較（個/5HP，±s）

表4 兩組不同時點肝細胞凋亡數的比較（個/5HP，±s）

與I/R 組同時點比較，aP<0.05

3 討論

在肝臟大手術的并發癥中，肝缺血/再灌注損傷一直是研究的重要方向，尤其是肝臟移植手術術中都存在肝缺血，肝缺血/再灌注損傷可以導致肝功能障礙甚至衰竭。肝缺血/再灌注損傷的病理機制尚未明確，目前認為是多種因素共同作用的結果，其中氧自由基的致傷機制在肝缺血/再灌注損傷中的作用已成共識[14]。中性粒細胞和Kupffer 細胞激活產生大量氧自由基，主要包括超氧化物自由基、氫氧根離子、過氧化氫等。氧自由基致傷機制主要有：氧化細胞膜磷脂雙分子結構中的脂質，改變細胞膜的通透性；損傷肝臟毛細血管內皮細胞，引起粒細胞、血小板聚集，阻礙微循環；抑制線粒體氧化磷酸化，減少肝細胞的ATP合成，肝細胞供能障礙；氧化核酸酶使DNA 雙鏈斷裂；激發有關調控基因，導致細胞凋亡等，并使大量炎性因子活躍，炎癥反應加劇，進一步加重肝細胞缺血/再灌注后的損傷[15]。

血清ALT、AST 大量存在于肝細胞中，肝細胞損害時釋放入血，導致血中ALT、AST 明顯升高，對肝損害反應靈敏，是目前臨床普遍應用的指標。SOD 是一種能通過歧化反應轉化超氧化物為氧氣和過氧化氫的抗氧化酶，能夠在體內清除超氧化物，保護組織細胞免受氧化損傷，發揮重要的氧化和抗氧化平衡作用[16]，測定SOD 活性是判斷缺血/再灌注損傷的間接指標。MDA 是氧自由基作用于細胞膜脂質過氧化反應的終產物，能影響線粒體酶活性和呼吸鏈，MDA 是細胞膜脂質過氧化反應最重要的產物之一，也是最常用的細胞膜脂質過氧化測定指標[17]。細胞凋亡是再灌注早期肝臟細胞死亡的重要機制[18]，細胞發生凋亡時會激活一些DNA 內切酶，內切酶使基因組DNA 斷裂，暴露出來的3′-OH 經過生物素標記和二氨基聯苯胺（DAB）染色后，在普通光學顯微鏡下可以觀察到凋亡細胞的細胞核呈棕黃色，而正常細胞則不染色。

NAC 是一種含巰基（-SH）的化合物，有直接抗氧化的作用是因為可以通過一個自由巰基與親電子的氧化基團發生作用，NAC 分子中的活性巰基可對抗氧自由基導致的細胞氧化損傷[19-22]。NAC 對體內氧自由基（O2-·、H2O2、·OH 等）具有顯著的清除作用。由于NAC 容易透過細胞膜，對能透過細胞膜的氧自由基（H2O2、·OH）具有拮抗和清除作用。張勇等[23]發現NAC 可以抑制大鼠肝臟缺血/再灌注引起的過氧化反應和減少氧自由基的生成。

本研究結果顯示，I/R 組肝損害血清學指標ALT、AST 在再灌注5 h 達到頂峰，脂質過氧化指標MDA也在再灌注5 h 達到最高，提示肝缺血/再灌注損傷以再灌注后5 h 最嚴重。兩組血清SOD 值于再灌注初期即開始降低，再灌注后5 h SOD 降到最低值，提示肝缺血/再灌注時有氧自由基的釋放和組織細胞的損傷，且I/R 組較I/R+NAC 組SOD 值下降更顯著，提示NAC 有一定氧自由基清除和拮抗作用。肝細胞切片用原位缺口末端標記法和瓊脂糖凝膠電泳法觀察發現兩組都有肝細胞凋亡，但I/R 組在再灌注后5 h 凋亡明顯比I/R+NAC 組嚴重，這也提示NAC 對肝缺血/再灌注損傷有保護作用。

綜上所述，氧自由基在肝缺血/再灌注損傷中起重要作用，NAC 通過抑制氧自由基釋放，清除氧自由基，抑制細胞膜脂質過氧化反應，減緩SOD 消耗，減少肝細胞凋亡，對肝缺血/再灌注損傷起保護作用。

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