CRISPR基因編輯技術在腫瘤研究中的應用

綜述

CRISPR基因編輯技術在腫瘤研究中的應用

李君紅，張富婷，桑春艷，王曉輝，惠玲

[作者單位]730050 蘭州，蘭州軍區蘭州總醫院醫學實驗中心 甘肅省干細胞與基因藥物重點實驗室

[關鍵詞]基因,腫瘤；基因,修飾；核糖核酸酶類；綜述

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.09.020

自2013年研究人員第一次展示成簇的規律間隔的短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat， CRISPR)基因編輯技術在真核細胞基因編輯方面的巨大潛力之后，近幾年在生物研究的各領域產生了革命性影響。在腫瘤研究方面，從基礎研究到臨床研究，再到轉化醫學的應用，CRISPR基因編輯技術均顯示出強大的生命力和廣泛的應用前景。為此，本文對CRISPR基因編輯技術在腫瘤研究方面的應用進行綜述，以期為腫瘤研究者提供資料。

1常規基因編輯技術在腫瘤研究中的應用及缺陷

腫瘤發生過程通常是由基因或表觀遺傳學層面造成原癌基因的激活或抑癌基因的失活(或二者皆有)所造成。原癌基因可由基因突變或表觀遺傳學的去甲基化而得到激活；而抑癌基因的失活則是由基因突變或表觀遺傳學甲基化而失去活性。在目前研究腫瘤發生相關基因的作用時，研究人員通常需要使用cDNA過表達和RNA干擾的方法從正反兩方面研究特定基因的潛在致癌或抑癌作用。

雖然這些方法在腫瘤研究過程中取得了豐碩成果，但也必須意識到這些傳統方法的一些缺陷：①在RNA干擾方面，由于RNA片段本身的不穩定性，研究人員通常無法精確確定RNA干擾對目的基因的抑制程度。②RNA干擾技術由于RNA片段本身長度的限制和簡并性，很容易造成嚴重的脫靶效應。這些負面效果可能在短期反應中并不明顯，但如需驗證特定基因在導致腫瘤發生的長期效應中所起的作用則會出現較大影響。③在cDNA過表達方面，常會在細胞或動物模型中造成超出正常生理范圍的基因過表達，這會導致細胞信號傳導通路的異常，因此不能正確反映特定基因的正常作用，從而對該基因致癌或抑癌功效的解讀產生誤導。根據目前腫瘤全基因組測序的結果來看，大部分基因突變在腫瘤發生發展過程中并不起直接作用，只有少部分基因突變對腫瘤發生發展起決定作用。利用現有常規基因編輯技術對腫瘤細胞進行研究，很可能對其相關基因突變造成誤判。④在體內實驗方面，研究人員通常需要通過同源重組對小鼠胚胎干細胞進行基因編輯，建立產生相應的具有特異突變位點的原癌基因或抑癌基因的轉基因小鼠模型來進行研究[1-3]。這種技術還可結合Cre和Flp位點特異性重組酶來生成可控激活的等位基因[4]。雖然此技術建立轉基因小鼠模型已經相當成熟，但我們必須看到依然存在靶向目標基因效率低、胚胎干細胞操作復雜以及小鼠飼養繁殖耗時費力等缺點。在轉基因小鼠模型中激活某特定基因通常是通過同源重組插入相關基因，而特異性失活某基因則通過非同源末端連接。研究人員近來通過使用位點特異的內切酶如鋅指核酸酶[5-7]和轉錄激活子樣效應因子核酸酶[8-10]來進行更為精確的基因組編輯，取得了很好的效果，但這種技術同樣存在花費巨大且編輯手段復雜繁瑣等缺點。

因此，亟需開發新的基因編輯技術，使研究人員能夠正常、長期、穩定、高效地調控特定基因的表達。

2CRISPR基因編輯技術的產生及應用

CRISPR基因編輯技術的實現可追溯到1987年，日本科學家Ishino等[11]首次在大腸桿菌IAP基因下游發現了奇怪的29 bp重復序列，與大多數序列重復元件不一樣的是，這種序列被32 bp的非重復序列所隔開。13年后，Mojica等[12]終于發現這種奇怪的序列在已知40%以上的細菌和90%的古生菌中廣泛存在。2002年，Jansen[13]和Mojica將這種序列正式命名為CRISPR。但其生物學意義尚未明確。在系統分析CRISPR序列的間隔非重復序列信息后，研究者發現CRISPR序列來源于染色體外，起源于噬菌體[14-16]。這個發現揭示了CRISPR序列在細菌中潛在的功能價值。最為重要的是，同年Mojica等[14]發現病毒無法感染含有與其基因序列相同的CRISPR間隔序列的古生菌。這些研究表明CRISPR序列可能具有免疫記憶及防御的作用。CRISPR中的間隔序列可以通過堿基配對來發揮抵抗細菌噬菌體的作用。2007年，Barrangou等[17]第一次通過實驗驗證CRISPR間隔序列可以通過與細菌噬菌體相應序列的配對來發揮適應性免疫反應。隨后，Brouns等[18]發現在大腸桿菌中CRISPR序列可被轉錄為包含CRISPR間隔序列的小CRISPR RNA(crRNA)來引導Cas核酸酶活性。同年，Marraffini等[19]發現在表皮葡萄球菌中CRISPR體系可阻止質粒的結合，說明Cas核酸酶的作用目標是DNA而非RNA。在隨后的幾年中，關于CRISPR系統的更多信息被逐漸揭示。2008年，Deveau等[20]發現PAMs在CRISPR序列的識別中起著重要作用。至此，CRISPR系統各元件在細菌免疫系統中的基本作用及運行方式得到基本闡明，但其生物學研究才剛剛開始。2010年，研究人員開始利用CRISPR系統進行一些生物技術方面的研究，如使用CRISPR系統建立具有噬菌體抗性的培養基[21]，以及利用CRISPR系統來進行菌種的系統進化分析等[22-23]。2011年，Sapranauskas等[24]第一次展示CRISPR系統可以在不同菌株中移植并發揮作用。2012年，兩項研究發現純化的Cas9可以在體外實驗中通過crRNA的引導切割目標DNA[25-26]。2013年，利用CRISPR系統對哺乳動物基因組進行定向切割，至此通過同源重組或非同源末端連接修復進行的基因編輯技術終于得到實現[27-28]。目前，CRISPR基因編輯技術迅速發展，并在很多模式動物體系中得到應用。

3CRISPR/Cas9基因編輯技術原理

CRISPR/Cas9是一種RNA介導的DNA內切酶，通過一個與目標序列互補的單引導RNA(single guide RNA， sgRNA)引導定位到基因組的目標序列上，此目標序列必須與一個以NGG或NAG形式的PAM序列相鄰。CRISPR/Cas9在與目標序列結合后，在特定基因組區域產生雙鏈斷裂。DNA雙鏈斷裂可被兩種DNA修復機制修復：同源重組或非同源末端連接修復。同源重組修復可通過提供外源性DNA模板插入特異序列，包括產生點突變、加入報告基因、插入標記或進行基因修正等。而非同源末端連接修復則可以通過產生插入或缺失突變，從而引起移碼突變或產生提前終止密碼等。通過CRISPR/Cas9介導在目標基因片段上產生DNA雙鏈斷裂，再通過同源重組或非同源末端連接修復機制引入突變或新的基因，就可達到特異性基因編輯的目的。CRISPR/Cas9基因編輯技術原理見圖1。

圖1　CRISPR/Cas9基因編輯技術原理

4CRISPR/Cas9基因編輯技術在小鼠腫瘤模型構建上的應用

在體外基因修飾方面，有文獻報道通過CRISPR/Cas9基因編輯技術對淋巴瘤細胞Trp53基因進行編輯修飾后轉入同源小鼠，成功證明了Trp53基因在腫瘤細胞化療抗性中所起的作用[29]。有學者通過慢病毒介導的CRISPR/Cas9基因編輯技術對小鼠造血干細胞及其祖細胞上的多個基因位點進行基因編輯，得到了大量的小鼠急性骨髓白血病細胞模型[30]。利用同樣的技術手段，相關文獻報道對小鼠造血干細胞及其祖細胞進行實驗，證明Mll3是急性骨髓白血病單劑量不足的一個抑癌基因[31]。

根據目前基因組全序列提供的信息，在人類和小鼠基因組上存在大量可供CRISPRR/Cas9基因編輯技術進行染色體重組改造的位點。目前，Blasco等[32]應用攜帶cas9和sgRNA基因的載體的慢病毒感染小鼠，成功實現了體染色體重組小鼠模型的構建。Maddalo等[33]利用攜帶cas9和兩個sgRNAs基因的載體的腺病毒氣管內灌注小鼠導入Cas9和sgRNA基因，從而誘導產生了EML4-ALK倒置的原癌性染色體重組小鼠模型。除了使用病毒作為遞送體系進行CRISPR/Cas9基因編輯外，應用脂質體或納米材料作為CRISPR/Cas9基因編輯遞送系統的相關研究也得以實現[34-35]。CRISPR/Cas9基因編輯方法見圖2。

圖2　CRISPR/Cas9基因編輯方法

另外，有學者還構建出了組成型表達Cre誘導的Cas酶活性小鼠模型[35]，這種小鼠可使研究者僅需要通過載體將sgRNA轉入Cas酶活性小鼠模型中就可完成基因編輯的目的。這種模型的成功構建將極大簡化基于CRISPRR/Cas9基因編輯技術的小鼠模型構建，對利用CRISPR/Cas9基因編輯技術建立新的小鼠腫瘤模型大有幫助。

5CRISPR/Cas9基因編輯技術介導的多基因修飾

CRISPR/Cas9基因編輯技術的一大優勢是能夠同時向胚胎干細胞導入多個基因進行修飾。有學者利用CRISPR/Cas9基因編輯技術一次性干涉小鼠胚胎干細胞8個等位基因；還利用CRISPR/Cas9基因編輯技術在小鼠胚胎8細胞階段同時干涉兩個基因，一步法得到雙敲除小鼠模型[36]。在后續研究中，有學者利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建了觸發性的以Cre-loxP為基礎的等位基因及報告基因[37]。這些研究均證實了CRISPR/Cas9基因編輯技術在構建多重失活/激活突變小鼠模型或胚胎干細胞中的優越性。這對快速構建腫瘤相關基因工程小鼠模型將會有巨大的推動作用。Shendure實驗室利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，基于同源重組修復機制，實現了在特定基因組區域的系統化多重基因修飾，這為腫瘤致癌熱點區域的分析提供了有力手段[38]。除可方便快捷地建立新的動物模型外，CRISPR/Cas9基因編輯技術還可用于對已經建立的動物腫瘤模型進行再編程，引入更多的組成性或觸發性原癌基因或抑癌基因，為系統了解原癌基因或抑癌基因相關信號通路在腫瘤發生發展中所起的作用提供更為簡單快捷的手段。

由于CRISPRR/Cas9基因編輯技術可在一個動物模型中同時進行多個基因編輯，這將為系統化、網絡化研究腫瘤發生發展的分子機制提供有力條件。因腫瘤相關的基因突變通常受多因素調控，而且患者本身的遺傳信息也存在異質性。利用CRISPRR/Cas9基因編輯技術在動物模型中可以更大程度模擬臨床病例的遺傳信息異質性，這對全面了解臨床病例腫瘤發生發展的原因，并相應開發適宜的化療及放射治療手段具有重要意義。

6CRISPR/Cas9基因編輯技術在腫瘤研究上的其他應用

由于CRISPR/Cas9基因編輯技術具有特異性通過sgRNA定位到基因組特異序列的特點，研究人員通過基因改造，將其HNH和RuvC樣催化域進行突變，得到了不具有內切酶活性的失去DNA切割活性的Cas9蛋白(dead cas9， dCas9)。dCas9保留了其RNA介導的DNA結合的能力，將其與特異的效應子結合可選擇性激活或抑制目的基因[39-44]，達到基因調控的目的。相對于傳統的基因調控方法，這種手段是在原位激活或抑制基因表達，克服了病理性高表達、抑制效率不穩定、脫靶效應高等傳統方法存在的諸多缺點，對腫瘤細胞信號傳導機制的研究大有裨益。除此之外，研究人員還利用CRISPR/Cas9基因編輯技術在體外構建了新的嵌合抗原受體修飾T細胞[45]，這種細胞可被精確定位到特異位點上[46]。腫瘤細胞發生發展的一個重要條件就是逃避機體免疫識別，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術改造機體免疫細胞，從而達到重新特異性識別腫瘤細胞的目的，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術逃避機體免疫識別將可能成為腫瘤免疫療法的新方向。

7結語

CRISPRR/Cas9基因編輯技術具有靈活多變、操作簡單、應用廣泛等諸多優點，目前已經成為基因編輯領域的新寵。利用CRISPRR/Cas9基因編輯技術可對胚胎干細胞進行多次、同時多位點的基因編輯，并能在短時間內高效率篩選出大量成功編輯的胚胎干細胞樣本；還可對已經建立的轉基因小鼠模型進行重編輯，得到新的嵌合轉基因小鼠模型。另外，利用其多重基因編輯的特性，針對臨床個體基因異質性產生相應的多重轉基因細胞或動物模型來達到個性化治療及藥物篩選的目的，也將對轉化醫學提供新的契機。CRISPRR/Cas9基因編輯技術在腫瘤研究中的應用，將極大加快腫瘤發生發展相關信號傳導通路的研究進展，同時也為腫瘤治療策略提供了新的思路。

[參考文獻]

[1]Smithies O, Gregg R G, Boggs S S,etal. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination[J].Nature, 1985,317(6034):230-234.

[2]Thomas K R,Folger K R, Capecchi M R. High frequency targeting of genes to specific sites in the mammalian genome[J].Cell, 1986,44(3):419-428.

[3]Mansour S L, Thomas K R, Capecchi M R. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes[J].Nature, 1988,336(6197):348-352.

[4]Frese K K, Tuveson D A. Maximizing mouse cancer models[J].Nat Rev Cancer, 2007,7(9):645-658.

[5]Bibikova M, Golic M, Golic K G,etal. Targeted chromosomal cleavage andmutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases[J].Genetics, 2002,161(3):1169-1175.

[6]Bibikova M, Beumer K, Trautman J K,etal. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases[J].Science, 2003,300(5620):764.

[7]Urnov F D, Miller J C, Lee Y L,etal. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases[J].Nature, 2005,435(7042):646-651.

[8]Christian M, Cermak T, Doyle E L,etal. Targeting DNA double-str, breaks with TAL effector nucleases[J].Genetics, 2010,186(2):757-761.

[9]Li T, Huang S, Jiang W Z,etal. TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed of TAL effectors, FokI DNA-cleavage domain[J].Nucleic Acids Res, 2011,39(1):359-372.

[10]Hockemeyer D, Wang H, Kiani S,etal. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases[J].Nat Biotechnol, 2011,29(8):731-734.

[11]Ishino Y, Shinagawa H, Makino K,etal. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product[J].J Bacteriol, 1987,169(12):5429-5433.

[12]Mojica F J, Diez-Villasenor C, Soria E,etal. Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria[J].Mol Microbiol, 2000,36(1):244-246.

[13]Jansen R, van Embden J D, Gaastra W,etal. Identification of a novel family of sequence repeats among prokaryotes[J].OMICS, 2002,6(1):23-33.

[14]Mojica F J, Diez-Villasenor C, Garcia-Martinez J,etal. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements[J].J Mol Evol, 2005,60(2):174-182.

[15]Pourcel C, Salvignol G, Vergnaud G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies[J].Microbiology, 2005,151(Pt 3):653-663.

[16]Bolotin A, Quinquis B, Sorokin A,etal. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin[J].Microbiology, 2005,151(Pt 8):2551-2561.

[17]Barrangou R, Fremaux C, Deveau H,etal. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J].Science, 2007,315(5819):1709-1712.

[18]Brouns S J, Jore M M, Lundgren M,etal. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes[J].Science, 2008,321(5891):960-964.

[19]Marraffini L A, Sontheimer E J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA[J].Science, 2008,322(5909):1843-1845.

[20]Deveau H, Barrangou R, Garneau J E,etal. Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus[J].J Bacteriol, 2008,190(4):1390-1400.

[21]Mills S, Griffin C, Coffey A,etal. CRISPR analysis of bacteriophage-insensitive mutants (BIMs) of industrial Streptococcus thermophilus-implications for starter design[J].J Appl Microbiol, 2010,108(3):945-955.

[22]Horvath P, Romero D A, Coute-Monvoisin A C,etal. Diversity, activity, and evolution of CRISPR loci in Streptococcus thermophilus[J].J Bacteriol, 2008,190(4):1401-1412.

[23]Horvath P, Coute-Monvoisin A C, Romero D A,etal. Comparative analysis of CRISPR loci in lactic acid bacteria genomes[J].Int J Food Microbiol, 2009,131(1):62-70.

[24]Sapranauskas R, Gasiunas G, Fremaux C,etal. The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli[J].Nucleic Acids Res, 2011,39(21):9275-9282.

[25]Jinek M, Chylinski K, Fonfara I,etal. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J].Science, 2012,337(6096):816-821.

[26]Gasiunas G, Barrangou R, Horvath P,etal. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2012,109(39):E2579-E2586.

[27]Cong L, Ran F A, Cox D,etal. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J].Science, 2013,339(6121):819-823.

[28]Mali P, Yang L, Esvelt K M,etal. RNA-guided human genome engineering via Cas9[J].Science, 2013,339(6121):823-826.

[29]Malina A, Mills J R, Cencic R,etal. Repurposing CRISPR/Cas9 for in situ functional assays [J]. Genes Dev, 2013, 27(23): 2602-2614.

[30]Heckl D, Kowalczyk M S, Yudovich D,etal. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing[J].Nat Biotechnol, 2014,32(9): 941-946.

[31]Chen C, Liu Y, Rappaport A R,etal. MLL3 is a haploinsufficient 7q tumor suppressor in acute myeloid leukemia[J].Cancer Cell, 2014,25(5):652-665.

[32]Blasco R B, Karaca E, Ambrogio C,etal. Simple, rapid in vivo generation of chromosomal rearrangements using CRISPR/Cas9 technology[J].Cell Rep, 2014,9(4):1219-1227.

[33]Maddalo D, Manchado E, Concepcion C P,etal. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system[J].Nature, 2014,516(7531):423-427.

[34]Zuris J A, Thompson D B, Shu Y,etal. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro, in vivo[J].Nat Biotechnol, 2015,33(1):73-80.

[35]Platt R J, Chen S, Zhou Y,etal. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing, cancer modeling[J].Cell, 2014,159(2):440-455.

[36]Wang H, Yang H, Shivalila C S,etal. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering[J].Cell, 2013,153(4):910-918.

[37]Yang H, Wang H, Shivalila C S,etal. One-step generation of mice carrying reporter, conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering[J].Cell, 2013,154(6):1370-1379.

[38]Findlay G M, Boyle E A, Hause R J,etal. Saturation editing of genomic regions by multiplex homology-directed repair[J].Nature, 2014,513(7516):120-123.

[39]Gilbert L A, Larson M H, Morsut L,etal. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes[J].Cell, 2013,154(2):442-451.

[40]Bikard D, Jiang W, Samai P,etal. Programmable repression, activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system[J].Nucleic Acids Res, 2013,41(15):7429-7437.

[41]Gilbert L A, Horlbeck M A, Adamson B,etal. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression, Activation[J].Cell, 2014,159(3):647-661.

[42]Esvelt K M, Mali P, Braff J L,etal. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation, editing[J].Nat Methods, 2013,10(11):1116-1121.

[43]Tanenbaum M E, Gilbert L A, Qi L S,etal. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression, fluorescence imaging[J].Cell, 2014,159(3):635-646.

[44]Konermann S, Brigham M D, Trevino A E,etal. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex[J].Nature, 2015,517(7536):583-588.

[45]Sadelain M, Brentjens R, Riviere I. The basic principles of chimeric antigen receptor design[J].Cancer Discov, 2013,3(4):388-398.

[46]Sadelain M, Papapetrou E P, Bushman F D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome[J]. Nat Rev Cancer, 2012,12(1):51-58.

(收稿時間：2015-06-15修回時間：2015-07-12)

[文獻標志碼][中國圖書資料分類號]R394.21A

[文章編號]2095-140X(2015)09-0095-05

[通訊作者]惠玲，E-mail:zyhuil@hotmail.com

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(81372177)；全軍醫藥衛生科研基金課題資助項目(CLZLZJB04)

·論著·