Th1/Th2/Th17細胞因子及抗心肌抗體在小鼠擴張型心肌病中的表達及其意義

李麗萍　孔清　賴文盈　潘曉芬　伍偉鋒

(廣西醫科大學第一附屬醫院心內科，廣西心血管病研究所，廣西南寧　530021)

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·論著·

Th1/Th2/Th17細胞因子及抗心肌抗體在小鼠擴張型心肌病中的表達及其意義

李麗萍孔清賴文盈潘曉芬伍偉鋒

(廣西醫科大學第一附屬醫院心內科，廣西心血管病研究所，廣西南寧530021)

摘要目的：觀察Th1/Th2/Th17細胞因子及抗心肌抗體在小鼠擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)中的表達, 并探討其在DCM發病機制中的作用及意義。方法： 用柯薩奇病毒 B3(CVB3)建立Balb/c小鼠DCM模型(DCM組)；對照組注射磷酸鹽緩沖液(PBS)。第24周處死小鼠，采用心肌Masson’s染色法觀察心肌組織纖維化程度；應用蛋白芯片檢測血漿中Th1、Th2、Th17細胞因子的表達；采用ELISA方法檢測小鼠血漿中的抗心肌抗體，如抗線粒體內膜ADP/ATP載體(adenine nucleotide translocator, ANT)抗體、抗β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain, β-MHC)抗體、抗心肌L型鈣通道(cardiac L-type calcium channel, CACH2)抗體、β1 腎上腺素能受體(anti-β1-adrenergic receptor，β1AR)抗體的水平。結果：DCM組在病毒感染24周后的心肌病理檢查結果符合DCM特征；與對照組比較，DCM組血漿中白細胞介素(IL)-2、IL-10、IL-13、IL-28及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達下降，而IL-6、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23及轉化生長因子-β(TGF-β)的表達均明顯升高(P均<0.05)。同時，DCM組小鼠血漿中抗ANT及抗心肌β-MHC抗體較對照組明顯升高(P均<0.05)；相關性分析結果顯示，DCM組小鼠血漿中IL-22水平與抗ANT抗體水平呈正相關(P<0.05)。結論：抗心肌抗體(如抗ANT抗體、抗β-MHC抗體)和Th1/Th2/Th17細胞因子(如IL-2、IL-10、IL-13、IL-28、TNF-α、IL-6、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23)及TGF-β失衡導致的免疫紊亂可能在DCM發病中起重要作用，且IL-22可能促進抗ANT抗體的產生。

關鍵詞細胞因子；抗心肌抗體；擴張型心肌病

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一種臨床常見病，已成為僅次于缺血性心肌病和瓣膜性心臟病的第三大心力衰竭的病因[1-3]。迄今為止，尚未完全明確DCM的發病機制。自身免疫異常是DCM的發病機制之一，可以直接損傷心肌，啟動心室重塑，引起心臟形態和功能的變化[4- 5]。DCM發病過程中，細胞免疫的改變主要表現為T細胞功能變化及其細胞因子系統異常，如Th1、Th2、Th17細胞亞群及其細胞因子的改變[6- 7]。DCM發病過程中體液免疫異常主要表現為心肌特定抗原決定簇的自身免疫性抗體的異常表達。目前已知的抗心肌自身抗體(antiheart autoantibodies, AHAs)有抗線粒體內膜ADP/ATP載體(adenine nucleotide translocator, ANT)抗體、抗β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain, β-MHC)抗體、毒蕈堿乙酰膽堿受體 M2 (muscarinic acetylcholine receptor M2，CHRM2) 抗體、β1 腎上腺素能受體(anti-β1-adrenergic receptor，β1AR) 抗體、抗心肌L型鈣通道(cardiac L-type calcium channel, CACH2)抗體等[8-10]。除心臟移植外，目前仍無可以從根本上逆轉DCM心肌細胞損害的確切有效的治療手段，故DCM預后極差。本研究參考張召才等[11]的報道，以B3型柯薩奇病毒(coxsackie virus group B type 3,CVB3)重復感染Balb/c小鼠建立DCM動物模型，采用蛋白芯片技術檢測Th1/Th2/Th17細胞因子表達，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)技術檢測抗心肌抗體的水平，以期為DCM的免疫治療提供新的證據和思路。

1資料與方法

1.1材料4周齡SPF 級雄性Balb/c小鼠由國家嚙齒類實驗動物種子中心湖南分中心提供(湖南斯萊克景達實驗動物有限公司)，許可證號：0062353-SCXK(X)2009-0004; CVB3由廣西醫科大學微生物教研室提供(Nancy株)；蛋白芯片購自美國RayBiotech公司。

1.2方法

1.2.1建立動物模型CVB3 Nancy 株經人喉癌細胞系活化增殖，當細胞病變程度達75%以上(+++～++++)時收獲，測得50%組織培養感染濃度 (TCID50)為10-7。隨機取15只雄性4周齡BALB/c小鼠，腹腔接種CVB3，制作DCM動物模型。具體方法為：首月腹腔接種含10-5/mL CVB3病毒的磷酸鹽緩沖液(PBS)0.1 mL，其后每月接種相同批次的CVB3，逐月遞增0.05 mL。另取7只雄性4周齡BALB/c小鼠，作為對照組，腹腔注射不含病毒的PBS。統計小鼠死亡數。于24周后處死組小鼠，眼眶采血并留取血漿；取心臟組織，用于Masson’s染色。

1.2.2心肌組織的病理學檢查取2組小鼠的心肌組織，用10%甲醛固定后石蠟包埋，然后進行Masson’s染色, 在光鏡下觀察心臟的病理改變。采用Image-proplus 6.0軟件計算膠原容積積分(collagen volume fraction，CVF)，CVF =膠原面積/全視野面積×100%。

1.2.3血漿細胞因子的檢測嚴格按照試劑盒說明書操作，將芯片完全干燥，每個孔中加100 μL的樣品稀釋液，室溫在搖床上孵育30 min，封閉定量抗體芯片。吸出每個孔中的緩沖液后，加100 μL的標準液和樣品到各孔中，在搖床上孵育2 h后吸出每個孔中的標準液和樣品。用洗液反復清洗后，加入80 μL的檢測抗體至每個孔中，在搖床上室溫孵育2 h。用洗液反復清洗后，添加80 μL的Cy3-鏈霉親和素到每個孔中，避光，搖床上室溫孵育1 h。用洗液反復清洗，然后用荷蘭Axon公司GenePix激光掃描儀掃描，并采用QAM-TH17-1數據分析軟件進行數據分析。

1.2.4血漿抗心肌抗體的表達水平檢測按試劑盒說明書，采用ELISA法分別檢測血漿中抗ANT、抗β-MHC、抗CACH2、抗β1AR抗體的水平, 檢測最低限分別為0.156 ng/mL、0.156 ng/mL、0.100 ng/mL、0.156 ng/mL。

2結果

2.1一般情況DCM組小鼠的生存率為66.7%(10/15)，對照組小鼠生存率為100%(7/7)。

2.2心肌組織的病理學檢查對心臟組織切片進行Masson’s染色(圖1)，結果發現，DCM組首次接種病毒24周后，心肌細胞排列明顯紊亂，藍色膠原明顯增多，心肌纖維束縱橫交錯而將心肌細胞呈島狀分隔開來，心腔較對照組明顯擴大；對照組未見明顯纖維增生。

圖1　心肌組織Masson’s染色(×400)

2.3心肌組織的CVFDCM組CVF為(18.32±5.47)%，對照組為0，P<0.05。

2.4各組小鼠細胞因子的表達水平蛋白芯片分析結果顯示，DCM組小鼠的血漿白細胞介素(IL)-6、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23及轉化生長因子-β(TGF-β)的表達量均高于對照組，而IL-2、IL-10、IL-13、IL-28及TNF-α均低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。而DCM組小鼠的血漿IL-1β、IL-4、IL-5、IFN、MIP-3a的蛋白表達水平與對照組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1　 DCM組與對照組細胞因子的蛋白表達水平比較

2.5各組小鼠抗心肌抗體水平ELISA結果顯示，DCM組中血漿抗ANT抗體及抗β-MHC抗體的表達量均高于對照組(P<0.05)；DCM組抗CACH2抗體和抗β1AR抗體的含量與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2　小鼠血漿抗ANT抗體、抗β-MHC抗體、抗CACH2抗體、抗β1AR抗體表達量

2.6DCM組小鼠抗心肌抗體與IL-22水平的相關性分析相關性分析結果顯示，DCM組中血漿IL-22與抗ANT抗體水平呈正相關(R=0.856,P=0.031)，而與抗β-MHC抗體、抗CACH2抗體、抗β1AR抗體水平均無相關性(P均>0.05)。

3討論

DCM的發病機制迄今尚未完全闡明，心內膜心肌活檢發現30%~40%DCM患者的心肌有慢性炎性反應，其中病毒感染引起的心肌損傷及由此引發的免疫紊亂在DCM中發揮重要作用，且心肌炎和DCM被認為是同一疾病的不同階段[12]。近年來，DCM中細胞因子和自身免疫抗體誘發的免疫反應引起了研究者們的興趣，如IL-17、IL-22、ANT抗體、β1AR抗體等[10, 12-14]。這提示我們，DCM免疫紊亂是立體的、多層面的，涉及復雜的細胞因子網絡失衡。

Th1、Th2、Th17細胞是目前已知的參與DCM發病的重要T輔助細胞亞群，它們主要通過分泌細胞因子并形成細胞因子網絡而在DCM中發揮生物學效應。本研究通過病毒重復增量感染的方法建立感染性DCM的小鼠模型[11,15]，并采用蛋白芯片技術分析Th1/Th2/Th17細胞因子在DCM中的表達情況。結果表明，與對照組比較，DCM小鼠血漿中IL-2、IL-10、IL-13、IL-28及TNF-α表達下降，而IL-6、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23及TGF-β表達明顯升高。本研究與以前的一些相關研究[4, 10, 13- 14]的結果不完全一致，這可能是由不同的技術方法導致，本實驗采用蛋白芯片技術，而以往研究多采用ELISA技術等。

本課題組的前期研究[10, 14]表明，抗ANT抗體和抗心肌β-MHC抗體參與小鼠病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)的發病 。VMC與DCM 屬于同一疾病的不同階段，參與兩者發病機制的抗心肌抗體是否有所不同呢？本研究表明，DCM組中血漿抗ANT抗體及抗β-MHC抗體的表達量均高于對照組，而DCM組抗CACH2抗體和抗β1AR抗體的含量與對照組的差異無統計學意義。由此提示，抗CACH2抗體和抗β1AR抗體可能并未參與DCM 的發病機制，而抗ANT抗體及抗β-MHC抗體可能參與了VMC及DCM發病機制。抗ANT抗體直接與心肌細胞線粒體ANT結合，導致細胞能量代謝失調。此外，抗ANT抗體還能與心肌細胞漿膜上的鈣離子通道發生交叉反應，引起心肌細胞內鈣超載。抗心肌β-MHC自身抗體可特異性結合正常心肌肌球蛋白，引起心肌細胞炎性浸潤、壞死或凋亡，最終引起心肌收縮功能障礙、心力衰竭[10, 14]。本課題組發現，抗ANT抗體及抗β-MHC抗體在VMC及DCM中均明顯升高，兩者可能共同作用，參與了VMC向DCM進展的過程。

有研究[16]在VMC患者中發現IL-17參與了VMC患者抗心肌抗體的產生過程。本課題組用IL-17A基因敲除小鼠進行的試驗也證明，IL-17A參與VMC小鼠抗ANT抗體的產生[10]。這些證據提示，細胞因子可能參與抗心肌抗體的產生。我們在DCM患者中發現，產生IL-22的Th22細胞數量與ANT水平呈正相關，提示IL-22可能參與抗心肌抗體的產生。因此，我們進一步探索了DCM小鼠血漿中IL-22與抗心肌抗體的相關性。結果顯示，DCM組中血漿IL-22與抗ANT抗體水平呈正相關，而與抗β-MHC抗體、抗CACH2抗體及抗β1AR抗體含量均無明顯相關性。這些結果提示，IL-22可能促進了抗ANT抗體的的產生，抑制IL-22的表達，有可能會減輕DCM的免疫損傷，但其作用有待進一步研究證實。

綜上所述，除抗心肌抗體，如抗ANT、抗β-MHC抗體可能參與了DCM的發病外，Th1/Th2/Th17細胞因子如IL-2、IL-10、IL-13、IL-28、TNF-α、IL-6、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23及TGF-β失衡導致的免疫紊亂亦可能在DCM發病中起重要作用，且IL-22可能促進抗ANT抗體的的產生。這些表達異常的細胞因子及抗心肌抗體進行的網絡調節，可能為治療DCM提供新的思路和途徑。

參考文獻

[1]Rakar S, Sinagra G, Di Lenarda A, et al. Epidemiology of dilated cardiomyopathy. A prospective post-mortem study of 5252 necropsies. The Heart Muscle Disease Study Group[J]. Eur Heart J,1997,18(1): 117-123.

[2]Sparrow PJ, Merchant N, Provost YL, et al. CT and MR imaging findings in patients with acquired heart disease at risk for sudden cardiac death[J]. Radiographics,2009,29(3): 805-823.

[3]Taylor MR, Carniel E, Mestroni L. Cardiomyopathy, familial dilated[J]. Orphanet J Rare Dis,2006,1: 27.

[4]Fairweather D, Stafford KA, Sung YK. Update on coxsackievirus B3 myocarditis[J]. Curr Opin Rheumatol,2012,24(4): 401-407.

[5]Cihakova D, Rose NR. Pathogenesis of myocarditis and dilated cardiomyopathy[J]. Adv Immunol,2008,99: 95-114.

[6]Dandel M, Wallukat G, Potapov E, et al. Role of beta(1)-adrenoceptor autoantibodies in the pathogenesis of dilated cardiomyopathy[J]. Immunobiology,2012,217(5): 511-520.

[7]Jahns R, Boivin V, Schwarzbach V, et al. Pathological autoantibodies in cardiomyopathy[J]. Autoimmunity,2008,41(6): 454-461.

[8]Rawdanowicz J, Pikto-Pietkiewicz W, Marczynska M. Cardiovascular diseases associated with HIV infection and their management[J]. Kardiol Pol,2013,71(11): 1183-1187.

[9]Opavsky MA, Penninger J, Aitken K, et al. Susceptibility to myocarditis is dependent on the response of alphabeta T lymphocytes to coxsackieviral infection[J]. Circ Res,1999,85(6): 551-558.

[10]賴文盈, 伍偉鋒, 潘曉芬, 等. 白細胞介素-17A對病毒性心肌炎小鼠抗心肌抗體水平的影響[J]. 細胞與分子免疫學雜志,2014,30(6): 601-603.

[11]張召才, 楊英珍, 陳瑞珍, 等. 病毒性心臟病小鼠心臟膠原代謝的動態變化[J]. 中國病理生理雜志,2006,2(8): 1529-1534.

[12]Caforio AL, Tona F, Bottaro S, et al. Clinical implications of anti-heart autoantibodies in myocarditis and dilated cardiomyopathy[J]. Autoimmunity,2008,41(1): 35-45.

[13]Fan Y, Weifeng W, Yuluan Y, et al. Treatment with a neutralizing anti-murine interleukin-17 antibody after the onset of coxsackievirus b3-induced viral myocarditis reduces myocardium inflammation[J]. Virol J,2011,8: 17.

[14]Kong Q, Wu W, Yang F, et al. Increased expressions of IL-22 and Th22 cells in the coxsackievirus B3-Induced mice acute viral myocarditis[J]. Virol J,2012,9: 232.

[15]孔清, 潘曉芬, 賴文盈, 等. 白細胞介素-27在慢性心肌炎及擴張型心肌病中的表達[J]. 嶺南心血管病雜志,2014,20(2): 228-232.

[16]Yuan J, Cao AL, Yu M, et al. Th17 cells facilitate the humoral immune response in patients with acute viral myocarditis[J]. J Clin Immunol,2010,30(2): 226-234.

Expressions and Significance of Th1/Th2/Th17 Cytokines and Antimyocardial Antibodies in Mouse Dilated Cardiomyopathy

LILipingKONGQingLAIWenyingPANXiaofenWUWeifengDepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,GuangxiInstituteofCardiovascularDiseases,Nanning530021,China

AbstractObjective：To observe the expressions of Th1/Th2/Th17 cytokines and antimyocardial antibodies in mouse dilated cardiomyopathy (DCM), and explore their roles and significance in DCM pathogenesis. Methods:BALB/c mouse model of DCM was built with coxsackievirus(CVB3). Mice in control group were treated with phosphate-buffered saline (PBS) i.p. Mice were killed at the 24th week, and the fibrosis degree of myocardial tissue was observed by myocardial Masson’s staining. Expressions of Th1/Th2/Th17 cytokines in plasma were detected by using protein microarray. The mouse plasma levels of antimyocardial antibodies such as adenine nucleotide translocator(ANT) antibody, β-myosin heavy chain(β-MHC) antibody, cardiac L-type calcium channel(CACH2), and anti-β1-adrenergic receptor(β1AR) were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results: The result of myocardial pathological examination in DCM group fit the features of DCM 24 weeks after virus infection. Compared with those in control group, expression levels of interleukin(IL)-2, IL-10, IL-13, IL-28 and TNF-α in DCM group decreased(P<0.05), however, the expression levels of IL-6, IL-17, IL-21, IL-22, IL-23 and TGF-β increased significantly(P<0.05). Meanwhile, compared with those in control group, the plasma levels of ANT and β-MHC antibodies in DCM group increased significantly (P<0.05). Furthermore, positive correlation was found between level of IL-22 and level of anti-ANT according to correlative analysis(P<0.05). Conclusions: Immunologic derangement induced by imbalance of antimyocardial antibodies such as ANT and β-MHC, and Th1/Th2/Th17 cytokines such as IL-2、IL-10、IL-13、IL-28、TNF-α、IL-6、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23 and TGF-β may play important roles in the pathogenesis of DCM. Furthermore, IL-22 may boost the production of ANT antibody.

Key WordsCytokine;Antimyocardial antibody;Dilated cardiomyopathy

通訊作者伍偉鋒, E-mail: wucna65@163.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(編號：81160032)

中圖分類號R 542.2

文獻標識碼A