早期肝癌甲胎蛋白陰性患者血清標志物的篩選和驗證

舒宏　曹昭　張舒　甘淋　秦雪　劉銀坤

(1.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院檢驗科，南寧　530021；2.復旦大學肝癌研究所，

上海　200032；3.廣西醫科大學第一附屬醫院檢驗科，南寧　530021)

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·論著·

早期肝癌甲胎蛋白陰性患者血清標志物的篩選和驗證

舒宏1,2曹昭3張舒2甘淋2秦雪3劉銀坤2

(1.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院檢驗科，南寧530021；2.復旦大學肝癌研究所，

上海200032；3.廣西醫科大學第一附屬醫院檢驗科，南寧530021)

摘要目的：篩查甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)陰性的肝癌患者和肝硬化患者血清中的差異表達蛋白。方法： 選擇6例AFP陰性的肝癌患者和6例AFP陰性的肝硬化患者。應用MARS系統分離獲得各組血清標本中的低豐度蛋白，采用雙向熒光差異凝膠電泳(two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D-DIGE)技術篩選兩組間有表達差異的蛋白，并用蛋白質印跡法加以驗證。結果：2D-DIGE技術共鑒定出29種差異蛋白，其中AFP陰性肝癌患者血清中高表達的蛋白有22種，低表達的蛋白有7種。差異蛋白包括激肽原1、四連接素、基膜聚糖蛋白、補體1r和鋅α2糖蛋白等。蛋白質印跡法證實，AFP陰性的肝癌患者血清中鋅α2糖蛋白表達水平明顯低于AFP陰性的肝硬化患者(P<0.05)，同DIGE結果一致。結論：采用蛋白質組學技術篩查出的一系列在AFP陰性肝硬化和AFP陰性肝癌患者血清中有表達差異的蛋白有望作為AFP陰性肝癌患者早期診斷和輔助診斷的分子標志物。

關鍵詞肝腫瘤；肝硬化；雙向熒光差異凝膠電泳；蛋白質印跡法；甲胎蛋白

劉銀坤，E-mail: liu.yinkun@zs-hospital.sh.cn

全球范圍內，原發性肝癌患者的病死率居所有惡性腫瘤的第2位。肝癌發病隱匿，病死率較高，5年生存率較低[1]。目前，甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)是臨床上診斷肝癌的常用血清學標志物，但是約1/3的肝癌患者AFP表達陰性，而且在小肝癌(腫瘤直徑<5 cm)中AFP陽性率更低，僅為25%。除了AFP，用于診斷肝癌的標志物還有AFP-L3、α-L-巖藻糖苷酶(AFU)和脫-γ-羧基凝血酶原(DCP)，但它們的診斷敏感性較AFP差[2-3]。因此，從血清中尋找一種更特異、更敏感的肝癌早期診斷標志物具有重要的臨床意義，特別是尋找AFP陰性肝癌的早期診斷和輔助診斷的分子標志物。本研究采用雙向熒光差異凝膠電泳(two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D-DIGE)結合高通量的基質輔助激光解析電離-串聯飛行時間質譜(MALDI-TOF/TOF MS)鑒定方法對AFP陰性的肝硬化和肝癌患者血清中有表達差異的蛋白進行篩選，并對相關差異蛋白分子進行蛋白質印跡法驗證，以期尋找能早期診斷和輔助診斷AFP陰性肝癌的分子標志物。

1資料與方法

1.1血清收集與分組選取復旦大學附屬中山醫院、廣西醫科大學附屬腫瘤醫院和廣西醫科大學第一附屬醫院標本庫的AFP陰性的肝癌和肝硬化患者血清作為研究對象。(1)AFP陰性肝硬化組6例，納入標準：B型超聲診斷為肝硬化，AFP<20 ng/mL，乙肝表面抗原(HBsAg)陽性(+)，肝功能Child分級為A或B級；(2)AFP陰性肝癌組6例，納入標準：病理檢查確診為肝癌，且腫瘤結節<3 cm，無血管侵襲，無遠處轉移，AFP<20 ng/mL，HBsAg(+)，Child分級為A或B級。所有患者均是首次確診，血清標本均采集于治療前，分為兩份，分別用于2D-DIGE篩選和蛋白質印跡法驗證。

1.2試劑去除人14種高豐度蛋白的多重親和排除系統(multiple affinity removal system，MARS)由安捷倫科技(中國)有限公司提供。固相pH梯度(immobilized pH gradient，IPG)干膠條(24 cm，pH4～7)、5 nmol CyDye DIGE Fluor 最小標記試劑盒、Ettan2D-clean up試劑盒、DeStreakTM溶脹液、載體兩性電解質(IPG buffer，pH4～7)、過硫酸銨、CHAPS、Tris堿、TEMED、二硫蘇糖醇、尿素和硫脲均購自美國GE公司。丙烯酰胺、N,N-甲叉雙丙烯酰胺、硫脲及十二烷基磺酸鈉購自美國Sigma公司。苯甲基磺酰氟和碘乙酰胺分別購自日本和光純藥工業株式會社和瑞士Fluka公司。SameSpots差異分析軟件(4.0版)由Non-linear公司提供。超敏膠體考馬斯亮藍染色液試劑盒購自上海中科新生命生物科技有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.3設備EttanIPGphor 3 等點聚焦系統、Ettan DAL Tsix大型垂直灌膠系統、雙向垂直電泳儀和Ettan DIGE 掃描儀購自美國GE公司，495型梯度生成儀購自美國Bio-Rad公司，SHIMADZU LC-2010AHT和LC-20AD液相色譜儀購自日本島津公司，4700 MALDITOF/TOF質譜儀購自美國ABI公司。

1.4MARS系統分離血清標本中的低豐度蛋白按照MARS系統所帶的液相色譜標準操作程序，對每例血清樣品進行分離，除去高豐度蛋白，收集低豐度蛋白組分。并用BCA法測定各組血清標本中低豐度蛋白的濃度，再用2D-clean up試劑盒對待標記蛋白樣品進行純化。

1.5DIGE實驗設計和熒光染料的標記按標準的2D-DIGE實驗設計方法，本實驗共有6張凝膠。從AFP陰性肝硬化組和AFP陰性肝癌組患者中隨機各抽取6例血清樣本(標記為1～6)，每組樣本隨機混合，以消除個體差異。每組樣本有2次混合，肝癌組和肝硬化組分別用Cy3和Cy5標記；同時將所有12例樣本等量混合，作為內標，用Cy2標記。此外，準備了未標記的內標樣本1 mg，以進行超敏膠體考馬斯亮藍染色，然后用于質譜分析。

1.6雙向電泳IPG膠條(24 cm，pH4～7)置于IPGphor水平電泳儀上進行泡脹和聚焦，取1.5節中標記好的血清樣本混合液進行2D-DIGE，電泳條件：50 μA/膠條，75～80 kVh。等電聚焦電泳結束后，IPG膠條先后在十二烷基磺酸鈉平衡液Ⅰ和平衡液Ⅱ中各平衡15 min；將平衡好的IPG膠條轉移至8%～16%線性梯度的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上端，用0.5%的瓊脂糖(40～50℃)封膠；設置功率，避光條件下進行垂直電泳，直至溴酚藍達膠底線，然后用Typhoon激光共聚焦掃描儀對電泳結果進行掃描成像。同時取去高豐度蛋白后的未標記的血清樣品1 mg進行雙向電泳，具體操作同前；電泳結束后，先用超敏膠體考馬斯亮藍染色液染色，再掃描成像。

1.7圖像分析雙向電泳所得的蛋白質組圖譜用SameSpots軟件分析。根據軟件自帶的統計學分析工具(Progenesis Stats)進行組分分析、相關性分析、聚類分析和效能分析，觀察數據的變化趨勢。最后，將一張分析過的圖像作為用于切膠的圖像(Spot Picking)，與1 mg樣品的制備膠上染色點相匹配。根據P值大小將樣品差異點進行排序并編號，計算變化倍數，選取倍數>1.4的斑點為差異蛋白點。

1.8差異蛋白的膠內酶解和質譜鑒定切割差異蛋白質斑點至96孔板中，經過清洗和脫色，脫水干燥，37℃酶解過夜，提取蛋白并凍干。將蛋白樣品點靶于MALDI金屬上，用4700MALDI-TOF/TOF串聯飛行質譜儀進行鑒定。

1.9數據庫檢索差異蛋白名稱將質譜鑒定數據通過MASCOT軟件檢索NCBI非冗余數據庫。檢索參數：種類為Homo Sapian；酶為胰蛋白酶，允許有1個漏切位點；肽質量容忍差異為0.3；MS/MS容忍差異為0.4。

1.10蛋白質印跡法驗證差異蛋白收集另外一份血清進行蛋白質印跡法分析。原血清用PBS稀釋10倍后上樣3.5 μL，并加標準分子量蛋白，進行10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；電泳結束后，用半干電轉移法將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜，在含3%胎牛血清和0.05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液中封閉1 h；加入鼠抗人鋅α2糖蛋白多克隆抗體(工作液體積稀釋比例為1∶500)，室溫孵育1 h；再加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體(工作液體積稀釋比例為1∶5000)，室溫孵育1 h，然后將膜浸于ECL中染色3 min，暗室中曝光于X膠片上顯影，以目的蛋白條帶的灰度值表示該蛋白的相對表達量。

2結果

2.1DIGE圖譜匹配率及重復性分析將2組患者血清的低豐度蛋白采用最小標記法標記，然后分別經473、532和635 nm波長的激光進行掃描，共獲得18塊蛋白質組學圖譜，即膠內標圖譜、AFP陰性肝硬化圖譜和AFP陰性肝癌圖譜各6張，然后用SameSpots分析軟件進行批量分析，并將圖譜疊加(圖1)。18塊膠中被檢測到的蛋白質斑點最多的有490個，平均(407±36)個，AFP陰性肝硬化患者血清中被檢測到的蛋白質斑點有(417±48)個，AFP陰性肝癌患者血清中檢測到的蛋白質斑點有(382±22)個。

采用pH4～7的IPG膠條和濃度為8%～16%的梯度膠進行雙向電泳分離，電泳結束后凝膠經不同波長的激光掃描，獲得不同熒光標記的各樣品的單通道圖像。A：Cy2標記的混合血清內標；B：Cy3標記的AFP陰性肝硬化患者血清；C：Cy5標記的AFP陰性肝癌患者血清；D：3個不同熒光標記樣品的疊加圖像

圖1AFP陰性肝硬化和肝癌組患者血清中蛋白表達的雙向熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)圖譜

2.2AFP陰性肝硬化和肝癌患者血清中差異表達蛋白的篩選與鑒定采用SameSpots軟件對差異蛋白質斑點進行分析及篩選。篩選條件：蛋白質點在多于2/3的膠上出現，蛋白差異在 1.4倍以上，P<0.05且power>80%。比較各組之間的差異蛋白質點后，共分析出189個差異點，其中AFP陰性肝癌患者血清中高表達的差異點有117個，AFP陰性肝硬化患者血清中高表達的差異點有72個。對篩選出的差異蛋白質點，在考馬斯亮藍染色的制備膠中切取到143個點，經酶切消化等處理后用MALDI-TOF/TOF質譜儀進行分析。結果顯示，這些蛋白質點中有40個獲得了較好的質譜圖。將肽質量指紋圖譜和MS/MS數據提交MASCOT在線檢索，共成功檢索出了29種分值>66的差異蛋白分子(表1~2)。其中，AFP陰性的肝癌患者血清中高表達的蛋白有22種，AFP陰性的肝硬化患者血清中高表達的蛋白有7種。這些差異蛋白包括新發現的激肽原1(kininogen 1)、四連接素(tetranectin)、凝溶膠蛋白異構體的前體(gelsolin isoform precursor)和基膜聚糖(lumican)，以及補體1r和鋅α2糖蛋白等。部分質譜鑒定結果(以補體1r為例)見圖2。

2.3鋅α2糖蛋白的蛋白質印跡驗證選取了AFP陰性肝癌患者血清中表達下調的差異蛋白鋅α2糖蛋白，分別在7例AFP陰性肝硬化和6例AFP陰性肝癌患者血清中進行蛋白質印跡法驗證。結果如圖3所示，鋅α2糖蛋白在肝癌組中表達量明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)，這一結果與2D-DIGE結果一致。

表1　AFP陰性肝癌患者血清中高表達蛋白的質譜鑒定結果(22種)

表2　AFP陰性肝癌患者血清中高表達蛋白的質譜鑒定結果(7種)

3討論

早期診斷肝癌已經成為世界性的難題。目前，雖然肝癌的血清標志物研究已經取得了很大進展，但是對AFP陰性肝癌患者的診斷，特別是AFP陰性小肝癌的診斷研究，國內外研究甚少[4]。在傳統雙向電泳的基礎上結合2D-DIGE熒光標記技術對AFP陰性肝癌患者的血清蛋白質譜進行分析，可以定量篩選出一系列與AFP陰性早期肝癌相關的差異蛋白。

本研究采用SameSpots圖像分析軟件，從AFP陰性肝癌和AFP陰性肝硬化患者的血清標本中鑒定出了大量的差異蛋白點，然后從NCBI數據庫中檢索獲得29種差異蛋白。其中，AFP陰性肝癌表達上調的蛋白22種，表達下調的蛋白7種。這些差異蛋白包括參與免疫應答的補體因子B和補體1r，參與凝血反應的激肽原 l變異體和激肽原1亞型2，還有作為骨架蛋白的鈣結合微絲蛋白和四連接素等。由于檢測的血清樣品經過了去除高豐度蛋白的前期處理，因此，鑒定出的差異在1.4倍以上的蛋白中，除了白蛋白和免疫球蛋白重鏈外，其他均為低豐度蛋白；并且這些蛋白所涉及的功能廣泛，包括免疫應答、補體激活、血液凝固、脂質代謝、分子轉運和細胞周期等。

A：145號蛋白質點補體1r的MALDI-TOF-TOF肽指紋圖譜；B：補體1r肽段(質荷比為1 638.9)的串極肽序列圖譜和肽段序列；C：補體1r的理論氨基酸序列，下劃線所示為匹配序列，含圖B的肽段序列

圖2差異蛋白補體1r的基質輔助激光解析電離-串聯飛行時間質譜(MALDI-TOF/TOF MS)圖和肽段離子鑒定圖

6例AFP陰性肝癌患者[AFP(-)HCC]血清中鋅α2糖蛋白的平均表達水平比7例AFP陰性肝硬化患者[AFP(-)LC]明顯降低(P=0.025)

圖3蛋白質印跡法驗證兩組血清樣本中鋅α2糖蛋白的表達

本研究發現的一些差異蛋白與腫瘤有著密切的關系，包括細胞骨架蛋白、炎性反應和代謝免疫分子等。例如，基膜聚糖、激肽原1變異體及其亞型2在AFP陰性肝癌患者血清中表達水平明顯升高?；ぞ厶鞘羌毎饣|中的重要成分，在正常上皮和間質細胞中均有表達，其表達異常可能與整合素有關，從而影響腫瘤的轉移和侵襲[5]?；ぞ厶沁€在腫瘤增殖、浸潤或轉移病灶的形成過程中，通過生化合成及降解而重建細胞外基質[6]。激肽原l參與凝血和炎性反應。研究[7]發現，激肽原l變異體及其亞型2的表達水平隨著腫瘤患者病灶中血管生成的增加而升高。在肝癌患者血清中，巖藻糖基化的激肽原表達也高于肝硬化患者[8-9]。

對于肝癌，目前國內外已開展比較蛋白組學研究，發現了一系列的血清學候選標志物，包括一些酶類、細胞因子或生長因子等蛋白，還有糖蛋白及自身抗體等。本研究新發現了一些與肝癌早期診斷相關的差異蛋白分子，如補體因子B和補體因子1r等。這些差異蛋白與腫瘤微環境密切相關，包括細胞骨架蛋白、炎性反應和代謝免疫分子等。這些新發現的差異蛋白分子可能在肝癌的發生和發展過程中發揮著重要作用，有望作為血清標志物用于AFP陰性肝癌患者的早期診斷和輔助診斷。

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Screening and Identification of Serum Markers for α-Fetoprotein-Negative Patients with Early Stage Hepatocellular Carcinoma

SHUHong1,2CAOZhao3ZHANGShu2GANLin2QINXue3LIUYinkun2

1.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedTumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China; 2.LiverCancerInstitute,FudanUniversity,Shanghai200032,China; 3.DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China

AbstractObjective：To screen and identify the differentially expressed proteins in the serum of α-fetoprotein (AFP)-negative patients with liver cancer and AFP-negative patients with liver cirrhosis. Methods:Six patients with AFP-negative liver cancer and 6 patients with AFP-negative liver cirrhosis were enrolled. The low abundance proteins in serum samples from each group were isolated by MARS system.Then the differentially expressed proteins between the two groups were screened by two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2D-DIGE)technology. Furthermore, Western blotting was used to verify the differentially expressed proteins. Results: Totally, 29 differentially expressed proteins have been identified by 2D-DIGE technology. Among those proteins, 22 proteins were over-expressed in the serum from AFP-negative liver cancer patients, while 7 proteins were down-expressed. These differential proteins included kininogen 1, tetranectin, lumican, complement 1R and zinc-alpha-2-glycoprotein (ZAGP).By Western blotting, it was confirmed that the expression of ZAGP in patients with AFP-negative liver cancer was significantly lower than that in patients with AFP-negative liver cirrhosis (P<0.05), which was in accordance with the result of DIGE. Conclusions: A series of differentially expressed proteins were identified in the serum from AFP-negative patients with liver cirrhosis or liver cancer by using proteomic technology.These proteins might be used as molecular markers for the early diagnosis and assistant diagnosis of AFP-negative patients with liver cancer.

Key WordsLiver neoplasms;Liver cirrhosis;Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis;Western blotting;α-fetoprotein

通訊作者秦雪，E-mail: qinxue919@163.com；

基金項目：國家傳染病重大專項基金資助項目(編號：2012ZX10002012-002)

中圖分類號R735.7

文獻標識碼A