硫醚環化B螺旋肽通過抑制內質網應激減輕HK-2細胞的氧化應激損傷

李龍　鄭龍　胡超　林淼　龍亞秋　戎瑞明

(1.復旦大學附屬中山醫院泌尿外科，上?！?00032；2.中國科學院上海藥物研究所，上海　201203)

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·論著·

硫醚環化B螺旋肽通過抑制內質網應激減輕HK-2細胞的氧化應激損傷

李龍1△鄭龍1△胡超1林淼1龍亞秋2戎瑞明1

(1.復旦大學附屬中山醫院泌尿外科，上海200032；2.中國科學院上海藥物研究所，上海201203)

摘要目的：通過體外實驗探討硫醚環化B螺旋肽(thioether-cyclized helix B peptide, CHBP)對腎小管上皮細胞的保護作用及機制。方法： 體外培養人近端腎小管上皮細胞(human renal proximal tubular cell line, HK-2) 并分為Control組、H2O2組和CHBP組。H2O2組和CHBP組均通過500 μmol/L H2O2刺激4 h建立氧化應激損傷模型。CHBP組在建立氧化應激損傷模型1 h前加入20 nmol/L的CHBP。500 μmol/L H2O2刺激4 h后，檢測細胞的活性、凋亡情況以及氧化應激損傷程度。采用Western blotting和PCR技術檢測連接免疫球蛋白(binding immunoglobulin protein, BiP)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)以及下游NFE2相關因子2(NF-E2-related factor 2, Nrf2)信號通路中的分子表達水平，判斷內質網應激水平。結果：CHBP預處理可以減輕氧化應激導致的細胞毒性損傷；CCK-8試劑盒和原位末端標記法(TUNEL)檢測發現，CHBP預處理后細胞活性增加，凋亡減少，氧化應激和內質網應激水平下降。CHBP組Nrf2和血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1, HO-1)水平較H2O2組顯著升高。結論：CHBP預處理可以減輕HK-2細胞的氧化應激損傷，這一保護作用可能是通過抑制內質網應激和激活下游Nrf2信號通路實現的。

關鍵詞硫醚環化B螺旋肽；腎臟；腎小管上皮細胞；ER應激

△李龍和鄭龍對本文有同等貢獻，為共同第一作者。

在許多疾病的發展和治療過程中都可能出現腎臟缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)[1]。發生腎臟IRI時，腎小管上皮細胞(tubular epithelial cells, TECs)損傷的潛在機制包括免疫損傷、線粒體失功、內質網(endoplasmic reticulum, ER)應激以及半胱天冬酶caspase級聯反應[2]。預防TECs凋亡對于治療腎臟IRI尤為重要。

線性B螺旋表面肽HBSP(helix B surface peptide, HBSP)來源于促紅細胞生成素(erythropoietin, EPO)中非促紅細胞生成作用的B組螺旋表面疏水段，已證實它在多個器官的IRI中有保護作用[3-4]。研究表明，HBSP在治療IRI時比EPO更具優勢，因前者不作用于促紅細胞生成受體，故不會使紅細胞生成過多而導致血液黏滯。然而，HBSP的半衰期僅為2 min，限制了其臨床應用[3]。我們在前期研究[5]中通過對HBSP進行環化處理而合成了硫醚環化B螺旋肽(thioether-cyclized helix B peptide, CHBP)。CHBP的穩定性高于HBSP，且在腎臟發生IRI時可以保護腎功能，減輕組織炎性反應和細胞凋亡。本研究旨在探討CHBP在體外的有效性及發揮保護作用的機制。

ER應激在腎臟IRI進程和TECs凋亡中發揮重要作用[6]。在IRI過程中，氧化應激干擾氧化還原反應平衡，導致ER腔中錯誤折疊和展開的蛋白積累，從而引起ER應激[7]。異源性蛋白，比如使分子伴侶解離的連接免疫球蛋白(binding immunoglobulin protein, BiP)的相互作用可以啟動ER應激。ER應激中的特異反應稱為未折疊蛋白反應(unfolded protein response, URP)。溫和或一過性的ER應激引起適應性的URP而重建ER平衡[8]。NF-E2相關因子2(NF-E2-related factor 2, Nrf2)是一種關鍵的轉錄調節抗氧化蛋白，其調控的下游抗氧化酶包括血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1, HO-1)。Nrf2信號通路在適應性URP反應中被激活，保護TECs免受氧化應激損傷[9]。然而，IRI通常引起強烈的ER應激，從而導致另外一種URP階段即凋亡相。在這一階段，C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)聚集、肌醇酶1(inositol-requiring enzyme 1, IRE1)磷酸化、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)激活被認為是重要的啟動因素。通常認為，BiP和CHOP是ER應激的標志[2]。

基于ER應激在腎臟IRI中的關鍵作用，我們假設CHBP可以通過抑制ER應激來保護人腎小管上皮細胞株 HK-2免受氧化應激損傷，并通過實驗來驗證這一假設。

1資料與方法

1.1材料與試劑人腎小管上皮細胞株HK-2由復旦大學放射醫學研究所贈送；DMEM/F12培養基和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購置美國Gibco公司；CHBP由中國科學院上海藥物研究所提供[5]；CCK-8檢測試劑盒、GSH/GSSG檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒、核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒及一步法原位末端標記法(TUNEL)凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。BiP、CHOP、HO-1的一抗和內參抗體購自德國CST公司， Nrf2和Lamin B的一抗購自美國Santa Cruz公司。本實驗中引物序列見表1。

表1　PCR引物序列

1.2細胞培養和氧化應激模型的建立HK-2細胞用含10% FBS的DMEM/F12培養基在 37℃、CO2體積分數為5% 的培養箱中培養，常規換液、傳代，用處于對數生長期的細胞進行實驗。將HK-2細胞接種于六孔板中。待細胞貼壁且細胞融合度為80%時，應用含500 μmol/L H2O2的無血清培養基培養4 h，建立氧化應激模型。Control組不作任何處理，H2O2組僅接受氧化應激刺激，CHBP組在H2O2處理前1 h加入20 nmol/L CHBP。

1.3細胞活性檢測通過檢測CCK-8判斷HK-2細胞的增殖活性。將處于對數生長期的HK-2細胞以3×103個/孔的密度接種于96孔板，每孔100 μL，37℃、CO2體積分數為5% 的 培養箱中培養24 h后，建立氧化應激模型。同時設置正常對照組和空白對照組(僅含培養液)。每組設6復孔，并重復3次實驗。氧化應激模型建立后4 h加入10 μL CCK-8試劑，置于37℃、CO2體積分數為5% 的培養箱中培養2 h，在450 nm處測OD值。

1.4TUNEL檢測應用一步法TUNEL凋亡檢測試劑盒檢測HK-2細胞的凋亡情況。將處于對數生長期的HK-2細胞接種于24 mm玻片中，置于六孔板中在培養箱內培養24 h后，建立氧化應激模型。然后，用4%多聚甲醛固定細胞30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，加入含0.1% Triton X-100的PBS冰浴孵育2 min。根據說明書配置TUNEL檢測液，加到每個玻片上，37℃避光孵育60 min。用PBS洗滌，DAPI染色10 min后在熒光顯微鏡下觀察。

1.5實時定量PCR反應采用Trizol法提取各組細胞的RNA，應用美國Thermo Fisher公司生產的逆轉錄試劑盒將3~5 μg總RNA在20 μL反應體系中逆轉錄為cDNA；應用上海碧云天生物技術有限公司的Q-PCR SYBR Green Permix Ex TaqTM 試劑盒進行實時定量PCR檢測。

1.6Western blotting檢測成功建立氧化應激模型后，用PBS沖洗HK-2細胞2次后收集細胞，應用上海碧云天生物技術有限公司的蛋白抽提試劑盒分別提取各組細胞的核內蛋白和核外蛋白。Western blotting的實驗步驟參照文獻[10]， 采用Image-Pro plus 6.0軟件分析caspase-3、BiP、CHOP和HO-1蛋白的表達情況。

2結果

2.1氧化應激時，CHBP預處理可以提高HK-2細胞的活性，減少氧化應激損傷單獨應用CHBP對HK-2細胞的活性沒有影響，但CHBP預處理可以減輕H2O2刺激對HK-2細胞的損傷作用，最佳保護作用濃度為20 μmol/L(圖1A)，最佳給藥時間為刺激前1 h(圖1B)。與H2O2組相比，CHBP組的ROS水平明顯降低，GSH/GSSH明顯升高，表明CHBP可顯著較低氧化應激水平(圖1C、圖1D)。

圖1A：與H2O2組相比，20 μmol/L CHBP預處理可顯著降低H2O2對HK-2細胞的損傷，差異有統計學意義，P<0.001；圖1B：不同時間點用20 μmol/L CHBP處理HK-2細胞，以H2O2刺激前1 h給予CHBP的效果最佳，P<0.001；圖1C、1D：與H2O2組相比，CHBP預處理可顯著降低氧化應激水平，差異有統計學意義，P<0.001

圖1氧化應激反應中，CHBP預處理對HK-2細胞活性及氧化應激水平的影響

2.2CHBP預處理可減少氧化應激損傷導致的凋亡H2O2刺激可以啟動凋亡途徑，而caspase-3在凋亡進程中起關鍵作用。本實驗中，caspase-3活性檢測和Western blotting結果顯示，H2O2刺激后， caspase-3活性顯著升高，分裂的caspase-3表達明顯增強；而CHBP組較H2O2組caspase-3活性和分裂的caspase-3表達明顯下降。TUNEL檢測顯示，H2O2刺激后細胞凋亡數量明顯增多，而CHBP組凋亡較H2O2組明顯減輕。見圖2。

2.3CHBP預處理可降低氧化應激導致的ER應激Western blotting和PCR結果顯示， H2O2刺激后細胞中BiP和CHOP表達升高，而CHBP預處理可以顯著降低氧化應激引起的上述蛋白的表達(圖3)。

圖2A：H2O2刺激HK-2細胞引起的氧化應激反應中，caspase-3活性顯著升高，CHBP預處理可顯著降低caspase-3活性，差異具有統計學意義，P<0.01；圖2B：TUNEL檢測顯示H2O2刺激后細胞凋亡數量明顯增多，而CHBP組細胞凋亡明顯減輕；圖2C、2D：CHBP預處理顯著抑制氧化應激引起的分裂的caspase-3表達的升高，差異具有統計學意義，P<0.01

圖2氧化應激反應中，CHBP預處理對HK-2細胞凋亡的影響

圖3A和3B：RT-PCR和Western blotting檢測表明，H2O2刺激后HK-2細胞中BiP和CHOP表達升高，而CHBP預處理可以顯著降低氧化應激引起的上述蛋白的表達，差異具有統計學意義，P<0.01

圖3氧化應激反應中，CHBP預處理對HK-2細胞內質網信號通路的影響

2.4CHBP預處理激活下游Nrf2信號通路Nrf2和HO-1是適應性URP反應的重要效應分子。本研究顯示，H2O2刺激可以上調Nrf2和HO-1蛋白的表達，而CHBP預處理可以促進Nrf2和HO-1表達進一步升高，表明CHBP可以進一步激活適應性URP反應。見圖4。

3討論

HBSP由M. Brines教授于2010年首次合成，包含EPO 的B組螺旋表面的11個疏水氨基酸(QEQLERALNSS)[3]。在中風模型和腎臟IRI模型中已證實HBSP具有強大的組織保護作用。然而，由于線肽半衰期較短，HBSP需要反復給藥才能達到組織保護作用[10]。比如，在嚙齒類動物外周神經損傷模型中， HBSP需要以23.5 nmol/kg的劑量每2 d給藥1次，連續5 d，隨后每周1次，才可減輕炎性反應和長期的觸摸痛[11]。我們通過硫醚環化作用將線肽HBSP首尾連接而得到CHSP，大大增加了多肽的穩定性。前期研究[5]表明，CHBP同樣具有組織保護作用，且較HBSP穩定性更好。

TECs與腎臟IRI密切相關。在腎移植中，IRI可導致TECs凋亡，進一步引起腎功能損傷，導致移植腎功能延遲恢復，從而影響臨床獲益[12]。本課題組的前期研究[5]表明，環肽CHBP可以有效保護小鼠腎功能，減輕腎臟IRI。為了研究體外CHBP的保護作用，本研究中我們用H2O2刺激HK-2細胞以模擬體內腎臟IRI，研究CHBP對ER應激的影響。CCK-8檢測結果顯示，20 nmol/L CHBP即對HK-2細胞表現出較強的保護作用，后續實驗也沿用這一工作濃度(圖1)。本實驗通過檢測ROS水平和GSH/GSSG比值研究CHBP對細胞的保護作用。細胞抗氧化能力主要取決于谷胱甘肽的氧化還原狀態。在正常培養的細胞中，丟失的谷胱甘肽占胞內總谷胱甘肽的98%以上，通常用丟失的谷胱甘肽GSH和被氧化的谷胱甘肽GSSH的比值(GSH/GSSG)反應細胞的氧化還原狀態，GSH/GSSG較低表示細胞氧化應激損傷較重[13]。本研究發現，CHBP預處理可以明顯減輕氧化應激(圖1)。

圖4　氧化應激反應中，CHBP預處理對HK-2細胞Nrf2信號通路的影響

TUNEL染色顯示，與H2O2組相比，CHBP組中凋亡的TECs細胞數量明顯減少。半胱天冬酶caspase家族在凋亡的起始和效應階段發揮重要作用，該通路下游的 caspase-3尤為重要，一旦被上游信號激活，直接介導細胞凋亡[14]。前期對小鼠腎臟IRI模型的研究[5]表明，CHBP治療可以顯著降低caspase-3的表達。本研究發現，在HK-2細胞中，CHBP預處理可以抑制H2O2引起的caspase-3的活化(圖3A)。分裂的caspase-3是細胞凋亡的另一個典型標志，通過Western blotting檢測發現，CHBP預處理可減少H2O2引起的分裂的caspase-3的表達(圖3B)。

內質網是真核生物中非常重要的細胞器。在腎臟IRI中，ER應激被認為是引起TECs凋亡的重要原因。溫和的內質網應激與適應性URP相關，內質網可達到再平衡[14]。但是，IRI誘導強烈的ER應激，可使URP進入凋亡相并最終導致細胞凋亡，CHOP、IRE1和JNK均參與凋亡反應。作為重要的分子伴侶，BiP參與多肽折疊，并指導初期糖蛋白的結構性成熟[15]。因此，我們通過檢測CHOP和BiP表達水平來評價ER應激程度。結果表明，CHBP預處理可以降低H2O2引起的ER應激水平。根據以上結果我們推出，CHBP可以降低ER應激，使內質網應激從凋亡相向適應性反應轉變。

在URP適應性反應中， Nrf2分子介導抗氧化反應[16]。ER應激可活化PERK和IRE1α-JNK-Nrf2軸，這兩者均可活化Nrf2信號通路。作為重要的抗氧化調節基因，Nrf2與腎臟IRI密切相關。既往研究[17]表明，Nrf2敲除小鼠對IRI更加敏感。為了評估CHBP在URP中的作用，本實驗檢測了HK-2細胞中Nrf2的表達水平。結果顯示，CHBP預處理可顯著提高核內與核外Nrf2表達水平，表明CHBP預處理可以促進URP從凋亡相向適應性反應轉變。

綜上所述，對HK-2細胞進行CHBP預處理可以抑制ER應激，抑制凋亡，增強Nrf2信號通路，從而促進UPR反應從凋亡相向適應相轉變，減輕氧化應激損傷。

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Thioether-Cyclized Helix B Peptide Alleviate Oxidative Stress Damage of HK-2 Cells by Inhibiting Endoplasmic Reticulum Stress

LILong1△ZHENGlong1△HUChao1LINMiao1LONGYaqiu2RONGRuiming1

1.DepartmentofUrology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China; 2.ShanghaiInstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofSciences,Shanghai201203,China

AbstractObjective：To explore the protective effect of thioether-cyclized helix B peptide (CHBP) on renal tubular epithelial cells and its mechanism by experiment in vitro. Methods:Human renal proximal tubular epithelial cell line HK-2 cells were cultured in vitro and divided into control group, H2O2group and CHBP group. Oxidative stress damage models were established by stimulation with 500 μmol/L H2O2for 4 h. In CHBP group, 20 nmol/L CHBP was added to the culture medium 1 h prior to the establishment of oxidative stress model. After 4 h stimulation with 500 μmol/L H2O2, cell viability, situation of apoptosis, and severity of oxidative stress damage were measured. The expressions of Binding immunoglobulin protein(BiP), C/EBP homologous protein(CHOP), and the molecular in downstream NF-E2-related factor 2 (Nrf2) signaling pathway were detected by Western blotting and real-time PCR analysis, so as to evaluate the level of endoplasmic reticulum(ER) stress. Results: Oxidative stress induced cytotoxic injury could be alleviated by CHBP pretreatment. Kit-8(CCK-8) assay and TUNEL showed that, after CHBP pretreatment, cell viability increased, while cell apoptosis, oxidative stress and ER stress decreased. The levels of Nrf2 and heme oxygenase-1(HO-1) were significantly higher in CHBP group than those in H2O2group. Conclusions: CHBP pretreatment could alleviate oxidative stress damage of HK-2 cells, and the protective effect may be achieved by inhibiting ER stress and activating downstream Nrf2 signaling pathway.

Key WordsThioether-cyclized helix B peptide;Kidney;Renal tubular epithelial cell;Endoplasmic reticulum stress

通訊作者戎瑞明，E-mail：rong.ruiming@zs-hospital.sh.cn

基金項目：上海市衛生和計劃生育委員會基金項目(編號：2014JQ008A)；復旦大學附屬中山醫院青年基金(編號：2014ZSQN47)

中圖分類號R 69

文獻標識碼A