PRKAG2心臟綜合征中R302Q突變對心肌細胞糖原和鈣離子穩態的影響

張亞平　顏彥　宋振舉　童朝陽

(復旦大學附屬中山醫院急診科，*心內科，上海　200032)

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·論著·

PRKAG2心臟綜合征中R302Q突變對心肌細胞糖原和鈣離子穩態的影響

張亞平顏彥*宋振舉童朝陽

(復旦大學附屬中山醫院急診科，*心內科，上海200032)

摘要目的：探討PRKAG2心臟綜合征中R302Q突變對心肌細胞糖原和鈣離子穩態的影響。方法： 用表達增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)、PRKAG2-WT、PRKAG2-R302Q的腺病毒感染大鼠H9C2心肌細胞，同時設正常對照組。感染24 h和48 h后，采用過碘酸-雪夫(Periodic acid-Schiff，PAS)染色法進行糖原染色，觀察心肌細胞的糖原貯積；采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測細胞內糖原含量；同時用Rohd-2/AM活體染料進行鈣離子染色，然后采用流式細胞術分析鈣離子庫信號差異。結果：EGFP組與對照組糖原染色和含量結果無明顯差別；PRKAG2-WT組糖原染色和含量略微增強；PRKAG2-R302Q組糖原染色和含量明顯增強。各組的鈣離子穩態并未受到影響。結論：PRKAG2心臟綜合征中R302Q突變導致心肌細胞內糖原貯積，而鈣離子穩態并未受到影響，沒有鈣超載現象發生。

關鍵詞PRKAG2心臟綜合征；R302Q突變；糖原；鈣超載

PRKAG2心臟綜合征是一種常染色體顯性遺傳病，由PRKAG2基因突變造成[1]。PRKAG2基因編碼腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)的γ2調節亞基[2]。PRKAG2綜合征臨床表現為進行性心肌細胞糖原貯積、心肌肥厚、室性預激和傳導系統疾病[3-4]，甚至可能會發展成致命的室性心律失常，患者隨時有發生心臟性猝死的危險。PRKAG2心臟綜合征患者通常在30歲前發病，有傳導阻滯的患者更易發生心臟性猝死，相當一部分患者需要安裝永久起搏器。由于該病有心肌肥厚的表現，故患者常常被誤診為肥厚性心肌病。我們的前期研究[5]報告1例具有心肌肥厚和預激表型的PRKAG2綜合征患者；克隆PRKAG2基因并測序顯示，該患者帶有1個雜合的R302Q突變，PRKAG2基因B3切(剪切方式)，306位堿基G被A取代，302位精氨酸被谷氨酰胺取代，導致R302Q突變。2001年，Gollob等[6]首次報告PRKAG2綜合征的基因測序分析結果，證實患者都存在PRKAG2-R302Q突變，但在中國人群中未有報道。PRKAG2心臟綜合征的最典型的特點為心肌細胞糖原貯積，但關于R302Q突變對心肌代謝狀況的影響目前并無深入研究。因此，本研究在細胞水平上探究了PRKAG2心臟綜合征患者中R302Q突變對糖原貯積以及鈣離子穩態的影響。

1資料與方法

1.1材料DMEM高糖培養基(美國Gibco公司)，優級胎牛血清(美國Hyclon公司)，H9C2大鼠胚胎心肌細胞株(中國科學院上海生命科學院細胞資源中心)，鈣離子熒光探針Rohd-2/AM(日本同仁化學研究所)； 過碘酸-雪夫(Periodic acid-Schiff，PAS)糖原染色試劑盒(美國Sigma公司)。

1.2重組腺病毒的制備和感染應用AdEasyTM系統(美國Stratagene公司)包裝目的重組腺病毒，具體步驟參見說明書。本研究分別選擇表達增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)、PRKAG2-WT、PRKAG2-R302Q的腺病毒，同時設正常對照組。將H9C2心肌細胞種在12孔板各孔中的玻璃蓋玻片上，24 h后分為4組，每組6個孔。各組分別加入5~10 μL相應的重組腺病毒。分別于感染24 h和48 h后進行糖原染色、糖原含量檢測、鈣離子染色分析等。

1.3糖原染色糖原染色采用PAS染色法，光鏡下觀察心肌細胞的糖原貯積狀況。PAS陽性反應表現為細胞質內有紫紅色球狀顆粒。

1.4糖原含量的檢測采用糖原檢測試劑盒(ELISA法)，嚴格根據試劑盒要求，檢測細胞內糖原含量。

1.5鈣離子染色大鼠 H9C2心肌細胞感染表達EGFP、PRKAG2-WT、PRKAG2-R302Q的腺病毒48 h后，在培養皿中加入Rohd-2/AM染料進行鈣離子染色。再經過磷酸鹽緩沖液漂洗，消化成單細胞后采用流式細胞術進行鈣離子庫信號差異分析。

2結果

2.1糖原染色感染重組腺病毒后24 h和48 h的PAS染色結果相似。EGFP組與對照組糖原染色結果無明顯差別；PRKAG2-WT組糖原染色略微增強；PRKAG2- R302Q組糖原染色明顯增強；見圖1。

2.2糖原含量的檢測采用ELISA法檢測各組心肌細胞內糖原含量，結果顯示，EGFP組在24 h和48 h與正常對照組無差異(P>0.05)；PRKAG2-WT組細胞內糖原含量較正常對照組稍高，但是差異無統計學意義(P>0.05),而PRKAG2 - R302Q組與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

A：正常對照組；B：EGFP組；C：PRKAG2-WT組；D：PRKAG2-R302Q組

組別24h糖原含量P值48h糖原含量P值正常對照組0.2763±0.0021-0.2446±0.0020-EGFP組0.2520±0.00180.32970.2379±0.00170.3391PRKAG2-WT組0.2789±0.00160.51230.2502±0.00200.5165PRKAG2-R302Q組0.3667±0.0022*0.00690.2830±0.0030*0.0256

注：與正常對照組比較，*P<0.05為差異有統計學意義

2.3鈣離子染色通過鈣離子染色、流式細胞術分析大鼠H9C2心肌細胞鈣離子庫的信號差異，結果發現，EGFP組、PRKAG2-WT組、PRKAG2-R302Q組以及對照組的鈣離子穩態均未受到影響。

3討論

由于PRKAG2心臟綜合征患者心肌肥厚的表現與肥厚型心肌病極其相似，故臨床中極易將前者誤診為后者而耽誤治療。在攜帶PRKAG2突變基因的患者中，常存在心律失常，隨著心肌肥厚逐漸進展，易出現左心功能不全及心臟肥大[7-8]。然而，與編碼肌小節蛋白的基因突變引起的典型肥厚性心肌病相比較，PRKAG2突變患者經組織病理學檢查發現心肌纖維排列紊亂者罕見，心肌間質纖維化程度也很低[7]。這表明PRKAG2突變導致心肌肥厚的發病機制可能與肥厚性心肌病并不相同。國外對于PRKAG2基因相關突變的基礎研究[9]認為，突變引起腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性改變。AMPK是由α、β和γ 3個亞基組成的異源三聚體蛋白。其中，α亞基是AMPK的催化亞基，β和γ亞基是AMPK的調節亞基。AMPK激活后，通過增強葡萄糖攝取和脂肪酸氧化，促進葡萄糖轉運和糖酵解，維持細胞內能量代謝平衡。故AMPK活性增加會引起糖原異常貯積。有研究[9]在2005年發現，PRKAG2基因突變N488I可引起AMPK活性增加，引起心肌細胞糖原的異常貯積，該結論同時在T400N轉基因鼠的動物模型中得到證實。Gollob等[10]發現，PRKAG2基因突變R302Q引起AMPK活性降低，也引起心肌細胞大量糖原貯積及心肌肥厚表現；推測是否因先前AMPK活性增強引起糖原貯積，其后由于心肌肥厚后的負反饋導致AMPK活性降低。本研究亦發現R302Q突變導致心肌細胞糖原的大量貯積，其機制有待進一步研究。

鈣離子升高是心肌肥厚信號轉導發生、發展的中心環節。當心肌細胞受到機械牽張或心臟負荷增加時，心肌細胞內鈣離子濃度出現反應性增加。心肌細胞內鈣離子的升高可激活細胞內一系列依賴鈣離子的ATP酶，使ATP降解增加。這不僅使肌球蛋白和肌動蛋白脫耦聯受到抑制，而且使肌漿網和細胞質膜的鈣離子轉運受損，進一步使細胞質內鈣離子濃度升高。以此形成惡性循環，導致鈣離子超載。鈣離子超載可啟動鈣離子介導的信號轉導途徑，從而參與心肌肥厚的發生和發展。本研究從細胞水平證實，PRKAG2基因的R302Q突變對心肌細胞鈣離子庫沒有顯著影響，但存在AMPK活性紊亂引起的糖原貯積，具體機制有待進一步研究。

參考文獻

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Effect of R302Q Mutation on Glycogen and Calcium Ion Homeostasis of Cardiomyocytes in PRKAG2 Cardiac Syndrome

ZHANGYapingYANYan*SONGZhenjuTONGChaoyangDepartmentofEmergency,*DepartmentofCardiology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective：To investigate the effect of R302Q mutation on glycogen and calcium ion homeostasis of cardiomyocytes in PRKAG2 cardiac syndrome. Methods:The rat H9C2 cardiomyocytes were infected with adenovirus containing enhanced green fluorescent protein(EGFP), PRKAG2-WT, and PRKAG2-R302Q,meanwhile, normal control group was set up.After 24 h and 48 h,Periodic acid-Schiff(PAS) staining was used to observe cardiomyocyte glycogen storage, and the glycogen content in cells was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Meanwhile, Rohd-2/AM vital dye was used to carry out calcium ion staining,and then the signal differences among calcium stores were analyzed by flow cytometry. Results: There was no obvious difference regarding glycogen staining and content between EGFP group and control group. Glycogen staining and content was slightly enhanced in PRKAG2-WT group, while glycogen staining and content was obviously enhanced in PRKAG2-R302Q group.However, the calcium ion homeostasis in each group was not affected. Conclusions: R302Q mutation leads to intra cardiomyocyte glycogen accumulation in PRKAG2 cardiac syndrome. However, calcium ion homeostasis is not affected and there is no calcium overload.

Key WordsPRKAG2 cardiac syndrome；R302Q mutation；Glycogen；Calcium overload

通訊作者童朝陽，E-mail: tong.chaoyang@zs-hospital.sh.cn

基金項目：復旦大學附屬中山醫院青年基金項目(編號：QNJJ2012-09)

中圖分類號R 541

文獻標識碼A