無載體放射性碘標記MIBG的制備及初步生物分布

樊彩云，鄧新榮，劉子華，李鳳林，羅志福

(中國原子能科學研究院，北京 102413)

無載體放射性碘標記MIBG的制備及初步生物分布

樊彩云，鄧新榮，劉子華，李鳳林，羅志福

(中國原子能科學研究院，北京 102413)

無載體放射性碘標記間碘芐胍(no-carrier-added,n.c.a.123/131I-MIBG)在腫瘤、心肌顯像和神經內分泌腫瘤的治療方面有理論上優勢。首先合成了以多氟化合物為支持體的標記前體，對該前體進行了放射性碘標記、純化和初步生物分布實驗。結果顯示，無載體放射性碘125I標記MIBG在正常小鼠的心、脾、肺和腎上腺中的攝取顯著高于目前商用的放射性碘標記MIBG。利用該方法標記后產物不需要使用HPLC進行純化，適用于大規模臨床應用。

間碘芐胍；無載體；多氟化合物支持體

MIBG是腎上腺素能神經元阻滯劑溴芐胺和胍乙啶的類似物，也是神經遞質去甲腎上腺素的功能性類似物[1]。MIBG能與腎上腺素受體結合，且具有高度特異性，可與富含腎上腺素受體的組織和器官結合，如腎上腺髓質、心肌以及相關腫瘤。1994年美國FDA批準[131I]MIBG(Iobenguane Sulfate I 131TM，NDA20-084)用于診斷嗜鉻細胞瘤和神經母細胞瘤。2008年美國FDA批準[123I]MIBG(AdreViewTM)用于兒童和成年人神經內分泌腫瘤的診斷。目前臨床上使用的[*I]MIBG采用同位素交換法制備，得到的產品carrier-added(c.a.)[*I]MIBG中含有大量穩定的MIBG，比活度低，不利于疾病的診斷和治療，用藥量高時還會產生高血壓、惡心、頭昏等副作用。由于c.a.[*I]MIBG存在弊端，n.c.a.[*I]MIBG的制備和應用研究逐漸得到重視，研究表明，n.c.a.[*I]MIBG的診斷和治療效果優于c.a.[*I]MIBG[2-13]。與商業化的c.a.[*I]MIBG相比，n.c.a.[*I]MIBG的制備要復雜得多。自1993年以來，相繼出現了多種n.c.a.[*I]MIBG的制備方法[14-22]，但大多數方法均需要在標記后使用HPLC對標記產物進行純化，不利于大規模制備和臨床應用。由于125I較123/131I易得，本工作擬利用多氟化合物支持體制備n.c.a.[125I]MIBG，并進行初步生物分布研究，該方法的優勢在于標記前體的合成和標記后產物的純化相對簡單，將為n.c.a.[*I]MIBG大規模臨床研究及應用提供基礎。

1 實驗材料

1.1 主要儀器

模擬標記產物的分析條件：安捷倫1200高效液相色譜系統，美國安捷倫公司產品；HPLC柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18 柱(4.6×150 mm)；紫外檢測波長為230 nm；洗脫溶劑：20% CH3CN(0.1% H3PO4)-H2O(0.1% H3PO4)溶液，洗脫速度為1 mL/min；MIBG溶解于20% CH3CN(0.1% H3PO4)-H2O(0.1% H3PO4)溶液中，得到濃度為0.1 mg/mL的標準溶液；n.c.a.[125I]MIBG的分析條件：HPLC，Varian公司；GABI型放射性檢測器：Raytest公司；C18色譜柱：Hypersil ODS，4.6×250 mm；洗脫劑A為H2O(0.1%TFA)，洗脫劑B為CH3CN(0.1%TFA)；梯度洗脫程序為：0～30 min，0～100%溶劑B；30～32 min，100%溶劑B；32～35 min，100～0%溶劑B。

實驗動物：昆明小白鼠25只，18～20 g，清潔級，北京華阜康生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

三(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8-氟辛基)錫溴和氟固相萃取柱：Sigma-Aldrich公司；3-溴芐胺鹽酸鹽、1,2-二(氯二甲基硅)乙烷、叔丁基鋰、1H-吡唑甲咪鹽酸鹽和FC-72(全氟己烷)：Acros公司；MIBG：ABX公司；Na125I溶液：PerkinElmer公司；其他試劑均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司。

2 實驗方法

2.1 標記前體的合成

n.c.a.[*I]MIBG的制備路線如圖1所示。

圖1 n.c.a.[*I]MIBG的制備路線Fig.1 Preparation of n.c.a.[*I]MIBG

2.1.1 3-三(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8-氟辛基)錫芐胺(化合物2)的合成

3-溴芐胺鹽酸鹽(0.800 g，3.6 mmol)懸浮于15 mL CH2Cl2中，用10%NaHCO3溶液洗滌，有機相用無水Na2SO4干燥過夜。抽濾，旋蒸除去溶劑，得淺黃色油狀物。將此油狀物(0.543 g，2.92 mmol)溶于5 mL CH2Cl2，加入Et3N(0.720 g，7.13 mmol)，攪拌30 min。然后將1,2-二(氯二甲基硅)乙烷(0.654 g，2.92 mmol)溶解于CH2Cl2，并將其滴入3-溴芐胺中，在冰水浴下攪拌1.5 h后室溫攪拌過夜。旋蒸除去溶劑，加入5 mL正己烷，抽濾除去不溶物，旋蒸除去溶劑后得淺黃色油狀物。將該產物(200 mg，0.609 mmol)溶于10 mL THF，在-78 ℃下冷卻，向其中加入叔丁基鋰(1.6 mol/L，0.7 mL)，滴加完畢后繼續攪拌40 min。將3-三(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8-氟辛基)錫溴(0.688 g，0.555 mmol)溶于4 mL THF并滴入反應液中，然后在-78 ℃下攪拌2 h，然后恢復至室溫。向反應混合物中加入5 mL FC-72，攪拌10 min后加入10 mL CH3OH終止反應。分出FC-72相，再用FC-72萃取(5 mL×4)，合并FC-72相，旋蒸除去溶劑，得無色油狀物。向其中加入20 mL V(CH3OH)∶V(H2O)=9∶1溶液，用1 mol/L HCl調pH至4～5，攪拌過夜。向反應物混合物中加入4 mL 2 mol/L NaOH，攪拌5 min后旋轉蒸發除去CH3OH，用FC-72萃取(5 mL×4)，合并FC-72相。旋蒸除去溶劑得黃色油狀物，用硅膠柱純化得淺黃色油狀物(化合物2)[20]。用核磁共振(1H NMR和13C NMR)和質譜表征結構。

2.1.2 3-三(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8-氟辛基)錫芐胍(化合物3)的合成

將化合物2(100 mg)溶于5 mL CH2Cl2，加入1H-吡唑甲咪鹽酸鹽(23.15 mg，158 μmol)和Et3N(237 μmol)，室溫攪拌過夜。旋蒸除去溶劑，向殘余物中加入5 mL FC-72，用CH3CN萃取(4 mL×3)，旋蒸除去溶劑得淺黃色粘稠液體(化合物3)。用核磁共振(1H NMR和13C NMR)和質譜表征結構。

2.2 模擬標記

非放射性碘標記(模擬標記)MIBG的制備反應如圖2所示。將標記前體3-三(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8-氟辛基)錫芐胍溶于甲醇，制成20 g/L的溶液。取該溶液200 μL(3 μmol)，加入10 μL乙酸，混勻。向其中加入NaI·H2O(1.7 mg，9 μmol)，然后加入Iodogen(1.0 mg，2 μmol)。室溫振蕩4 min后加入200 μL飽和NaHSO3溶液終止反應。將反應混合物用2 mL水稀釋，然后用氟固相萃取(F-SPE)柱純化。使用前F-SPE柱先用6 mL水淋洗，再用80%的甲醇-水溶液淋洗。產物純化時先用6 mL水洗脫，再用80%甲醇-1 mol/L乙酸溶液洗脫即可得到產物MIBG。對純化后的產物進行質譜分析和HPLC分析。

圖2 模擬標記Fig.2 Non-radioactive iodination

2.3 n.c.a.[125I]MIBG的制備

將標記前體3-三(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8-氟辛基)錫芐胍溶于甲醇，制成5 g/L的溶液。向涂有Iodogen(20 μg，0.5 g/L)的反應管中加入該溶液100 μL(5 g/L)和5 μL乙酸，混勻。然后向其中加入Na125I溶液100 μL(48.1 MBq)，室溫振蕩4 min后加入100 μL飽和NaHSO3溶液終止反應。用Waterman濾紙為支持體，V(正丁醇)∶V(乙醇)∶V(氨水)(2 mol/L)=6∶1∶2為展開劑進行TLC分析，計算標記率。

將反應混合物用1 mL水稀釋，然后用氟固相萃取柱純化。先用6 mL水洗脫，再用6 mL 80%甲醇-1 mol/L乙酸溶液洗脫即可得到產物n.c.a.[125I]MIBG。純化后產物的放化純度用HPLC進行分析和計算。

2.4 n.c.a.[125I]MIBG在小鼠體內的生物分布

昆明小鼠25只，隨機分成5組。尾靜脈注射0.1 mL n.c.a.[125I]MIBG(約2.4×105Bq)，分別在注射0.5、1 、4、8、24 h后處死，取血、甲狀腺、心、肝、脾、肺、腎上腺、和腎等器官和組織，稱重并用γ-計數器測量放射性計數，然后計算單位組織的放射性攝取百分比。按相同方法進行c.a.[125I]MIBG的生物分布研究。

3 結果與討論

3.1 標記前體的合成

中間產物化合物2：產量為187 mg，產率27%。1H NMR (400 MHz, CDCl3)：δ 7.37(m，3H)，7.30(m, 1H)，3.90(s，2H)，2.31(m，6H)，1.84(bs，2H)，1.31(t，6H)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)：δ 143.73，136.85，134.81，134.54，129.16，128.58，46.56，27.82，-1.36；MALDI-TOF：1268.2(M+H)+。

終產物3-三(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8-氟辛基)錫芐胍(化合物3)：產量為96 mg，產率為93%。1H NMR(400 MHz，CD3OD)：δ 7.52～7.36(m，4H)，4.43(s，2H)，2.42(m，6H)，1.37(t，6H)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)：δ 158.78，139.93，137.83，136.97，136.11，130.10，129.20，46.09，28.73，-0.48；MALDI-TOF：1 310.4(M+H)+。

目前，固體聚合物作為標記前體支持體[15]和多氟化合物作為標記前體支持體[20]不必使用HPLC進行純化，在標記前體的結構中引入較大相對分子質量化合物作為支持體，在標記過程中目標產物[*I]MIBG可以從支持體上脫離下來。利用支持體本身的特點通過簡單的柱分離對標記產物進行純化，該過程不需要相對復雜的HPLC系統，有利于n.c.a.[*I]MIBG的大規模制備和臨床應用。采用多氟化合物作為標記前體支持體進行標記前體的合成，由于該化合物是可溶性的，能夠利用傳統分析技術對中間體和最終化合物進行純化和鑒定，更有利于得到高純度的標記前體。

3.2 模擬標記

由HPLC分析結果(圖3、圖4和圖5)可知，在相同實驗條件下模擬標記產物的保留時間與MIBG標樣的保留時間一致(Rt=4.3 min)。結合質譜鑒定為(兩者的分子離子峰均為276.0(M+H)+)目標產物MIBG。同時從模擬標記產物的HPLC譜圖上可以看到在Rt=6.2 min處有少量雜質，通過面積計算可以得出目標產物的純度約為98%，達到了進行標記實驗的要求。

圖3 模擬標記產物的HPLC譜圖Fig.3 UV HPLC chromatogram of non-radioactive iodination product

圖4 MIBG標樣的HPLC譜圖Fig.4 UV HPLC chromatogram of standard MIBG

圖5 模擬標記產物和MIBG標樣混合樣品的HPLC譜圖Fig.5 UV HPLC chromatogram of non-radioactive iodination product and standard MIBG

3.3 放射性碘標記

TLC分析結果顯示產物的標記率大于90%。HPLC分析表明(圖6)，標記產物經F-SPE柱純化后n.c.a.[125I]MIBG的放化純度大于98%，放化產率約80%。說明對該標記前體進行放射性碘標記后，通過簡單的氟固相萃取柱分離就可以對標記產物進行純化，符合進行生物實驗的要求。由此可見，與普通方法相比，該方法不需要使用HPLC分離即可得到高純度的n.c.a.[*I]MIBG，可以在短時間內制備較大量的n.c.a.[*I]MIBG，更有利于n.c.a.[*I]MIBG的臨床研究及應用。

3.4 n.c.a.[125I]MIBG在小鼠體內的生物分布

為了比較n.c.a.[125I]MIBG和c.a.[125I]MIBG在正常生物體內的分布信息，同時進行了n.c.a.[125I]MIBG和c.a.[125I]MIBG在正常小鼠體內的生物分布實驗，結果分別如表1和表2所示。并對n.c.a.[125I]MIBG和c.a.[125I]MIBG兩組數據進行了統計學分析。

圖6 n.c.a.[125I]MIBG的HPLC分析圖譜Fig.6 γ-HPLC chromatogram of n.c.a.[125I]MIBG

表1 n.c.a.[125I]MIBG在正常小鼠體內的生物分布Table 1 Biodistribution of n.c.a.[125I]MIBG in normal mice

注：1) P<0.05，2) P<0.01

表2 c.a.[125I]MIBG在正常小鼠體內的生物分布Table 2 Biodistribution of c.a.[125I]MIBG in normal mice

從表1和表2可以看出，n.c.a.[125I]MIBG和c.a.[125I]MIBG在正常小鼠的心、脾、肺和腎上腺中的分布存在顯著性差異，且n.c.a.[125I]MIBG的心/肝、心/肺放射性攝取比也高于c.a.[125I]MIBG，該結果與文獻報道一致[14]。說明n.c.a.[125I]MIBG的高比活度(約81.4 GBq/μmol比c.a.[125I]MIBG的比活度高出104～105倍)使含有腎上腺受體的器官中的放射性攝取提高，同時也提高了心肌和臨近器官(肝、肺)的比值。從理論上來說，n.c.a.[123I]MIBG可以提高c.a.[123I]MIBG的顯像質量[4-9,13]，n.c.a.[131I]MIBG可以增強治療效果[9-12]，降低[131I]MIBG的副作用，并能快速給藥。因此，無載體放射性碘標記MIBG可能在臨床診斷和治療方面存在很大優勢。目前臨床研究的結果支持n.c.a.[123/131I]MIBG的臨床應用，但是還需要進一步的臨床試驗證明其有效性是否與c.a.[123/131I]MIBG不同以及提供安全性方面的信息。

4 結論

本研究利用多氟化合物支持體成功制備了n.c.a.[125I]MIBG的標記前體，并進行了放射性碘標記和初步生物分布研究。HPLC分析表明，標記產物經氟固相萃取柱純化后n.c.a.[125I]MIBG的放化純度大于98%。由于該方法不需要使用HPLC分離即可得到高純度的n.c.a.[*I]MIBG，可以在短時間內制備較大量的n.c.a.[*I]MIBG，更有利于n.c.a.[*I]MIBG的臨床研究及應用。

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Preparation and Preliminary Biodistribution of No-Carrier-Added Meta[*I] iodobenzylguanidine

FAN Cai-yun, DENG Xin-ring, LIU Zi-hua, LI Feng-lin, LUO Zhi-fu

(ChinaInstituteofAtomicEnergy,Beijing102413,China)

No-carrier-added meta-[*I]iodobenzylguanidine((n.c.a.)[123/131I]MIBG) has been considered to be promising diagnostic agents for oncology and cardiology, or as targeted radiotherapeutics for neuroendocrine tumors. The synthesis of a fluorous supported precursor for the purification without HPLC of n.c.a.[*I]MIBG was presented and its structure was determined. The precursor was labeled with radioactive iodine and the preliminary biodistribution of n.c.a.[*I]MIBG was studied. The uptake of n.c.a.[125I]MIBG were significantly higher than that of c.a.[125I]MIBG in heart, spleen, lung and adrenals. This facile preparation method of n.c.a.[*I]MIBG would allow its wider application in clinic.

MIBG; no-carrier-added; fluorous supported; radioactive iodine labeling

10.7538/tws.2015.28.03.0148

2015-03-31;

2015-05-11

樊彩云(1977—)，女，河南浚縣人，副研究員，放射性藥物專業

羅志福,研究員,博士研究生導師，E-mail: luozhifu@ciae.ac.cn

TL92+3

A

1000-7512(2015)03-0148-07