溫度和鹽度對西藏擬溞抗氧化酶和脂質過氧化作用的影響

亢玉靜，趙 文，魏 杰

大連海洋大學 水產與生命學院，遼寧省水生生物學重點實驗室，大連 116023

溫度和鹽度對西藏擬溞抗氧化酶和脂質過氧化作用的影響

亢玉靜，趙 文*，魏 杰

大連海洋大學 水產與生命學院，遼寧省水生生物學重點實驗室，大連 116023

采用實驗生態學方法，研究了溫度(T=16、19、22、25、28℃)、鹽度(S=5、10、15、20、25)對西藏擬溞總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力以及脂質過氧化產物丙二醛(MDA)含量的影響。結果表明：溫度和鹽度能夠誘導西藏擬溞抗氧化應激反應，脅迫24h后，SOD、GPX活性及MDA含量在28℃、鹽度20時均達到最高值，分別為(37.18±1.97) U mg-1μg-1、(75.1±9.96) U mg-1μg-1和(12.24±2.12) nmol mg-1μg-1；48h后，高溫低鹽組(25—28℃、5—10)和高溫高鹽組(25—28℃、20—25)SOD、GPX活性及MDA含量顯著高于其他處理組(P<0.05)，在28℃，鹽度5時均達到最大值，分別為(19.25±3.48) U mg-1μg-1、(59.95±4.66) U mg-1μg-1和(4.98±0.66) nmol mg-1μg-1；溫度、鹽度以及這兩個因子之間對西藏擬溞體內SOD、GPX活性和MDA含量均有極顯著影響(P<0.01)。

西藏擬溞；溫度；鹽度；總超氧化物歧化酶；谷胱甘肽過氧化物酶；丙二醛

西藏擬溞(DaphniopsistibetanaSars，1903)隸屬溞科(Daphniidae)擬溞屬Daphniopsis，是一種冷水性鹽水枝角類，在我國主要分布于西藏、青海、新疆等高海拔、高寒、貧營養型鹽水水體。分布水體多為碳酸鹽型，水溫-2—18℃、鹽度2.7—35、pH8.7—10.4[1- 6]。枝角類作為海洋經濟動物養殖中的一種新的活餌料，國內外學者已對其進行了一系列的研究，其中蒙古裸腹溞(MoinamongolicaDaday)在海水中的大量培養和投喂試驗獲得了一定的成效[1]，但該溞屬喜暖性種類，在北方低水溫期培養需升溫而有其局限性，而西藏擬溞雖發育期比較長，繁殖力也低于蒙古裸腹溞，但仍高于海產橈足類，其耐低溫性可彌補上述缺憾，比較適合北方多數海產魚、蝦類育苗期的水溫條件，有望成為海水魚、蝦苗種階段的活餌料[7]。目前，國內外對西藏擬溞的自然分布[1]、生物學特征[1]、形態構造[8]、生活習性[9]、染色體核型[10]、耗氧率[7]和排氨率[11]等方面進行了研究，但有關于西藏擬溞對環境因子(溫度、鹽度、pH等)脅迫的生物抗性與細胞內保護酶系統的研究尚未見報道。環境脅迫可造成機體自由基代謝紊亂，體內活性氧含量及抗氧化酶活性發生變化，產生應激反應，若長期處于應激狀態會導致機體免疫防御能力下降，從而影響生物正常生長。抗氧化酶具有消除機體氧自由基的功能，對增強吞噬細胞防御能力和機體免疫功能有重要作用[12]。因此，研究西藏擬溞抗氧化效應對于探索其環境適應機制和提高機體抗氧化免疫能力具有重要意義。本文研究了溫度和鹽度對西藏擬溞總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)活力以及脂質過氧化產物丙二醛(MDA)的影響，旨在為西藏擬溞室內馴化及規模化培養條件、作為海水環境監測生物的可行性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的西藏擬溞系于2007年6月采自西藏那曲的納木卡錯，馴化培養于鹽度15的稀釋海水中，以混合餌料為食物。試驗前挑選300只相對同步、體格健壯的帶卵成溞，在溫度16℃、鹽度為15的稀釋海水中培養，待孤雌生殖第一代后，將幼溞挑出，繼續培養幼溞，如此反復，以獲得試驗所需的同步性良好的成溞，避免由于個體差異對試驗結果產生影響。

1.2 試驗條件

試驗用水來源于大連黑石礁近海，經沉淀、砂濾、300目篩絹網過濾、煮沸消毒，用純水調整到試驗所需鹽度。所有試驗均用250mL燒杯，裝入200 mL培養液，每燒杯放入成溞20只。溫度以光照培養箱控制，光照強度為1500lx，光周期為12 L∶12 D。培養期間用混合餌料(蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)：鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)：牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)：湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)=1∶1∶1∶2)作為餌料投喂。將配好的餌料，用淡水稀釋1倍后進行投喂，餌料濃度約為8.5—9.5×106個/mL。試驗所用個體均為20日齡成溞，其平均體長為(1.75±0.05) mm。

1.3 試驗設計

根據西藏擬溞對溫度及鹽度的耐受范圍，本試驗設計溫度分為16、19、22、25℃和28℃，鹽度分為5、10、15、20、25五個梯度，脅迫時間為24h和48h，共50個處理組，每一處理組設置3個重復。將在溫度16℃，鹽度15下培養出來的同步成溞(平均體長為(1.75±0.05)mm)放入250mL燒杯，每個燒杯20只，培養液200mL，試驗在光照培養箱中進行，溫度變幅在±0.5℃以內，試驗過程中不投餌。試驗結束后，將溞從燒杯中挑出，用濾紙吸除體表的水分，放入2mL離心管中，經電子天平稱得最終體質量(精確至0.0001g)。

1.4 粗酶液制備

用移液槍量取0.5mL預冷(4℃)的勻漿介質(pH 7.36，濃度0.01mol/L 的PBS緩沖液)加入裝有溞體的2mL離心管中，在冰浴的條件下進行超生波破碎(400安培，5s每次，間隔10s反復3—5次)，低溫高速離心(4℃,10000r/min，10min)，上清液備用。

1.5 酶活測定

采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒測定T-SOD、GPX活性和MDA、蛋白質含量，操作步驟按試劑盒說明進行。

SOD活性的測定 采用黃嘌呤氧化酶法測定，SOD活性定義：每毫克組織蛋白在1mL反應液中SOD抑制率達50.0%時所對應的SOD量為1個SOD活力單位(U)。

GPX活性的測定 采用二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)消耗法測定，GPX活性定義：每毫克蛋白質，每分鐘扣除非酶反應的作用，使反應體系中GSH濃度降低1μmol/L為1個酶活力單位(U)。

MDA含量的測定 采用硫代巴比妥酸法測定，過氧化脂質降解產物中的丙二醛(MDA)可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合，形成紅色產物，在532nm處有最大吸收峰，從而計算MDA含量。

可溶性蛋白含量的測定 采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量。

1.6 數據處理

采用SPSS18.0統計軟件進行數據處理和分析。數據結果為平均值±標準誤差(Mean±S.D.)表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 溫度和鹽度對西藏擬溞SOD活性的影響

圖1 溫度和鹽度對西藏擬溞SOD活性的影響Fig.1 Effect of temperature and salinity on the SOD activity of Daphniopsis tibetana Sars小寫字母不同表示同一鹽度下不同溫度處理組差異顯著(P<0.05)；大寫字母不同表示同一溫度下不同鹽度處理組差異顯著(P<0.05); SOD：超氧化物歧化酶 Superoxide dismutase

溫度和鹽度對西藏擬溞SOD活性的影響示于圖1。從圖1可見，溫度和鹽度對西藏擬溞體內SOD活性均有顯著影響(P<0.05)。脅迫24h后，同一鹽度下，西藏擬溞SOD活性隨著溫度的升高而升高，25℃和28℃與其他處理組相比，差異顯著(P<0.05)，在溫度28℃、鹽度20時SOD活性最高，為(37.18±1.97) U mg-1μg-1，其中鹽度為15時，隨著溫度的升高，西藏擬溞SOD活性變化不明顯，范圍(1.67±0.76)—(3.27±0.1) U mg-1μg-1。而在溫度分別為25℃、28℃時，隨著鹽度的升高，溞體內SOD活性變化幅度較為明顯，其范圍分別為(3.27±0.1)—(10.78±2.98) U mg-1μg-1，(1.67±0.76)—(37.18±1.97) U mg-1μg-1；在低溫組，隨著鹽度的升高其SOD活性變化較小。脅迫48h后，西藏擬溞SOD活性隨著溫度和鹽度的改變與24h有相同的趨勢，在鹽度5，28℃時，SOD活性達到最高(19.25±3.48) U mg-1μg-1，在相同溫度、鹽度條件下，隨著脅迫時間的延長，西藏擬溞SOD活性變化不明顯(圖1)。

2.2 溫度和鹽度對西藏擬溞GPX活性的影響

溫度和鹽度影響西藏擬溞體內GPX活性(圖2)。脅迫24h后，當鹽度為20及25時，隨著溫度的升高，西藏擬溞體內GPX活性呈先降低后升高的趨勢，變化較為明顯，其范圍分別(7.92±2.75)—(75.1±9.96) U mg-1μg-1、(8.07±0.98)—(31.65 ±1.7) U mg-1μg-1，而其他處理組GPX活性隨著溫度的升高而呈現先降低后升高再降低的趨勢；同一溫度下，隨著鹽度的升高，溞體內GPX活性呈現先升高后降低的趨勢。在溫度28℃，鹽度20時達到最高值(75.1±9.96) U mg-1μg-1，其中溫度為16℃時，隨著鹽度的升高，GPX活性變化不明顯。脅迫48h后，同一鹽度下，西藏擬溞GPX活性隨著溫度的升高呈先降低后升高趨勢，鹽度5，溫度25℃和28℃時，GPX活性顯著高于其他處理組(P<0.05)；同一溫度下，鹽度的升降能夠引起GPX活性的顯著改變(P<0.05)。在相同的溫度、鹽度條件下，隨著脅迫時間的延長，高溫低鹽組(25—28℃、5—10)GPX活性顯著增強，其他處理組變化不明顯(圖2)。

圖2 溫度和鹽度對西藏擬溞GPX活性的影響Fig.2 Effect of temperature and salinity on the GPX activity of Daphniopsis tibetana SarsGPX：谷胱甘肽過氧化物酶Glutathione peroxidase

2.3 溫度和鹽度對西藏擬溞MDA含量的影響

溫度和鹽度對西藏擬溞MDA含量有顯著影響(P<0.05)(圖3)。脅迫24h后，同一鹽度，MDA含量隨著溫度的升高呈先降低后升高的趨勢，其中，當溫度為28℃，鹽度為20時MDA含量最高(12.24±2.12) nmol mg-1μg-1；最小值為(0.26±0.02) nmol mg-1μg-1，對應的溫度為22℃，鹽度25。另外，鹽度為20時，MDA含量隨著溫度的升高而升高的幅度最大，范圍(0.43±0.13)—(12.24±2.12) nmol mg-1μg-1，鹽度為15時，溞體內MDA含量隨著溫度超過25℃而急劇降低(3.41±0.53)—(0.74±0.1) nmol mg-1μg-1；同一溫度下，MDA含量隨著鹽度的升高而先升高后降低，溫度為16℃時，隨著鹽度的升高，溞體內MDA含量變化不明顯。脅迫48h后，同一鹽度，隨著溫度的升高MDA含量先降低后升高，鹽度15時，MDA含量隨著溫度的升高變化不明顯；高于16℃，同一溫度下，隨著鹽度的升高，MDA含量均有顯著變化(P<0.05)，在28℃，鹽度為5時達到最高值(4.98±0.66) nmol mg-1μg-1。在相同溫度、鹽度下，隨著時間的延長，在高溫組(25—28℃)鹽度改變，MDA含量有所降低，其他處理組變化不明顯，其中在28℃，鹽度為25時，西藏擬溞全部死亡(圖3)。

圖3 溫度和鹽度對西藏擬溞MDA含量的影響Fig.3 Effect of temperature and salinity on the MDA content of Daphniopsis tibetana SarsMDA：丙二醛Maleic dialdehyde

2.4 西藏擬溞體內抗氧化酶活性方差分析

由表1統計分析結果所示，經雙因子方差分析，溫度、鹽度以及這兩個因子之間的交互作用對西藏擬溞SOD、GPX活性和MDA含量影響極顯著(P<0.01)。

表1 溫度和鹽度對西藏擬溞SOD、GPX活性和MDA含量影響的統計分析結果Table 1 Results of two-way ANOVA of the SOD、GPX and MDA for Daphniopsis tibetana Sars in different temperature and salinity

**為差異極顯著(P<0.01)

3 討論

3.1 溫度和鹽度對西藏擬溞抗氧化酶和脂質過氧化作用的影響

鹽度作為影響海洋無脊椎動物生存、生長和發育的一個重要環境因子，能夠直接影響動物體內滲透壓和離子濃度的調節[17]。西藏擬溞是一種能進行低滲和高滲雙向調節的廣鹽性鹽水枝角類，調節機制較為復雜。王巧晗等[15]通過鹽度(5、10、15、20、25)對西藏擬溞存活、生長、繁殖的影響發現，鹽度10，15組生長最快，壽命長于其他組，說明在最適鹽度范圍內，機體體內各器官的活動代謝處于平衡狀態，鹽度改變能夠影響西藏擬溞的生長發育。趙文等人曾在實驗室條件下設置鹽度5、10、15、20和25測定西藏擬溞耗氧率[7]、排氨率[11]。結果表明，該溞的個體耗氧率(IO)、比耗氧率(SO)及排氨率(NR)均隨鹽度升高而升高，說明隨著鹽度的升高，西藏擬溞的呼吸代謝增強。本試驗結果發現，GPX活性和MDA含量變化趨勢相同，隨著鹽度的升高呈先上升后下降趨勢，在鹽度20時達到最大值，而SOD活性隨著鹽度的升高呈先降低后上升趨勢，在鹽度15時達到最小值，說明鹽度的升降能夠引起西藏擬溞體內抗氧化酶及MDA含量的變化。有研究表明，抗氧化酶活力能夠隨代謝率和耗氧率的增加而升高[18]，本試驗結果與之相符，外界鹽度的改變，使西藏擬溞體內產生過多的活性氧自由基，為保護體內細胞免受氧化損傷，抗氧化酶活力升高。GPX活性變化趨勢與SOD活性相反，說明在低鹽度條件下GPX發揮主要作用，在高鹽度下SOD起主導作用，這可能與西藏擬溞對于低滲和高滲調節的機制有關。在低鹽度下，機體出現了一定的氧化損傷，可能是因為西藏擬溞對低鹽度較為敏感，體內產生的大量活性氧自由基超過了抗氧化酶的清除能力。在高鹽度下，MDA含量有所降低，可能是由于SOD的大量合成，清除了機體產生的大部分氧自由基，因而細胞內生成的脂質過氧化物較少，對西藏擬溞的氧化損傷有所降低。通過目前對西藏擬溞所做的研究發現，盡管西藏擬溞能夠在低鹽以及高鹽條件下生長一段時間，但是會導致機體自由基代謝紊亂，影響其健康生長發育。

3.2 溫度和鹽度交互作用對西藏擬溞抗氧化酶和脂質過氧化作用的影響

以往的研究多集中于溫度和鹽度對西藏擬溞生長生殖的影響，關于溫鹽交互作用對其抗氧化酶的研究還尚未見報道。通過本試驗統計分析結果顯示，溫度、鹽度以及兩個因子交互作用對西藏擬溞體內SOD、GPX活性和MDA含量均有極顯著影響(P<0.01)，說明西藏擬溞體內抗氧化酶活力不僅與溫度密切相關，還與鹽度有關。在本研究范圍內，溫度16℃時，隨著鹽度的改變以及脅迫時間的延長，西藏擬溞體內抗氧化酶活性和MDA含量變化相對不明顯，可能是與溫度較低有關；在19—22℃，低鹽或是高鹽條件下，西藏擬溞體內SOD、GPX活性以及MDA含量均相對較低，這與王巧晗等[15]的相關研究結果不一致，分析其原因是經過多年的實驗室條件馴化，隨著四季溫度的改變，遺傳基因可能有所變化，改變了原始的特性；通過本試驗還發現，隨著脅迫時間的延長，高溫低鹽環境下，西藏擬溞體內SOD、GPX活性以及MDA含量均有明顯增加，在高溫高鹽環境(28℃，鹽度25)下，西藏擬溞全部死亡，說明超過一定的溫度鹽度后，隨著時間的延長，雖然機體內抗氧化酶活性增強，但是仍然無法避免機體損傷甚至造成死亡現象。

在試驗過程中選擇不投餌，是因為考慮到餌料生物體內也含有SOD、GPX和MDA，而溫度和鹽度的改變也會影響西藏擬溞的攝食率，從而可能會導致機體內的生理生化指標發生變化，通過預實驗發現，西藏擬溞在饑餓48h后仍然能夠進行正常的生理活動，因此為了避免餌料對結果的影響，選擇試驗過程中不投餌。

綜上，通過本試驗可以反映出西藏擬溞體內SOD、GPX活性以及MDA含量能夠反映對水體溫度和鹽度的敏感性。結果發現，高溫條件下，鹽度改變能夠引起SOD、GPX活性和MDA含量的顯著升高，隨著時間的延長，低溫條件下，鹽度的改變，西藏擬溞SOD、GPX活性以及MDA含量較少，高溫低鹽及高溫高鹽促進了GPX的合成，但同時也增加了MDA含量，說明對機體造成了一定的氧化損傷，在28℃，鹽度25脅迫48h后，西藏擬溞全部死亡。由此可以看出，西藏擬溞對低溫條件下鹽度的升降有更強的適應能力，能夠存活一段時間；而對高溫條件下，鹽度的大幅度改變的適應力較差。西藏擬溞在短時間內能夠通過調動體內抗氧化酶活性等生理機制來緩解對外界環境的改變，但是隨著溫度的升高以及鹽度的改變，機體各機能會受到抑制，從而影響其生長發育乃至存活。因此，在今后大規模培養的過程中應避免長時間的溫度升高以及鹽度的大幅度升降，要注意保持水體溫度和鹽度的穩定。通過本試驗對西藏擬溞在溫度和鹽度脅迫不同時間后生理變化的研究，為環境因子對其他枝角類抗氧化酶系統的影響提供了數據和資料，并且為今后做較為系統的研究奠定了基礎。

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Effects of temperature and salinity on the activities of antioxidant enzymes and lipid peroxidation ofDaphniopsistibetanaSars

KANG Yujing, ZHAO Wen*, WEI Jie

CollegeofFisheriesandLifeScience,KeyLaboratoryofHydrobiologyinLiaoningProvince,DalianOceanUniversity,Dalian116023,China

The experiment was designed to evaluate the effects of temperature (16,19,22,25,28℃) and salinity (5,10,15,20,25) on the activity of total superoxide dismutase(T-SOD), glutathione peroxidase(GSH-PX) and maleic dialdehyde (MDA) ofDaphniopsistibetanaSars by means of the experimental ecology method under the laboratory conditions. The results showed that stress responses to temperature and salinity were induced in theD.tibetana.The activities of SOD,GPX and the content of MDA increased with temperature and salinity raised. After 24h-stress, the maxima were (37.18±1.97)U mg-1μg-1,(75.10±9.96)U mg-1μg-1and (12.24±2.12)nmol mg-1μg-1, respectively, when the temperature and salinity simultaneously reached 28℃ and 20;48 hours later, the activities of SOD,GPX and the content of MDA in the groups of high temperature of 25 and 28℃ except for those held at salinity of 15 were significantly higher than the others. While the maxima of (19.25±3.48)U mg-1μg-1, (59.95±4.66)U mg-1μg-1, (4.98±0.66)nmol mg-1μg-1, respectively,were observed in the group of temperature of 28℃ and salinity of 5. The above results indicated that there were significant affects of temperature and salinity on the antioxidant enzymatic activities(SOD, GPX) and lipid peroxidation(MDA) inD.tibetana(P<0.01).

DaphniopsistibetanaSars; temperature; salinity; total superoxide dismutase; glutathione peroxidase; maleic dialdehyde.

國家自然科學基金項目(31072210,40776065)

2013- 05- 05;

日期:2014- 04- 11

10.5846/stxb201305050925

*通訊作者Corresponding author.E-mail: zhaowen@dlou.edu.cn

亢玉靜，趙文，魏杰.溫度和鹽度對西藏擬溞抗氧化酶和脂質過氧化作用的影響.生態學報,2015,35(4):1037- 1044.

Kang Y J, Zhao W, Wei J.Effects of temperature and salinity on the activities of antioxidant enzymes and lipid peroxidation ofDaphniopsistibetanaSars.Acta Ecologica Sinica,2015,35(4):1037- 1044.