氣體交換與熒光同步測量估算植物光合電子流的分配

康華靖, 李 紅, 陶月良, 張海利，權(quán) 偉, 歐陽竹

1 中國科學(xué)研究院地理科學(xué)與資源研究所生態(tài)網(wǎng)絡(luò)觀測與模擬重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101 2 中國科學(xué)研究院禹城綜合試驗(yàn)站，北京 100101 3 中國科學(xué)研究院研究生院，北京 100049 4 溫州科技職業(yè)學(xué)院, 溫州 325006 5 溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 溫州 325026

氣體交換與熒光同步測量估算植物光合電子流的分配

康華靖1,2,3,4, 李 紅4, 陶月良5, 張海利4，權(quán) 偉4, 歐陽竹1,2,3,*

1 中國科學(xué)研究院地理科學(xué)與資源研究所生態(tài)網(wǎng)絡(luò)觀測與模擬重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101 2 中國科學(xué)研究院禹城綜合試驗(yàn)站，北京 100101 3 中國科學(xué)研究院研究生院，北京 100049 4 溫州科技職業(yè)學(xué)院, 溫州 325006 5 溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 溫州 325026

光合電子流分配是植物光合控制的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。然而，傳統(tǒng)電子流分配的計(jì)算方法存在諸多問題尚未引起人們的注意，如：(1)低估了光呼吸每釋放一個(gè)CO2分子所消耗的電子數(shù)；(2)混淆了相對(duì)電子傳遞速率和絕對(duì)電子傳遞速率；(3)忽略了除碳同化和光呼吸外的其他電子流分配途徑；(4)難以準(zhǔn)確獲取光下暗呼吸速率值，從而導(dǎo)致碳同化電子流(JC)及光呼吸速率(Rp)的不準(zhǔn)確估算等。以小麥和大豆氣體交換與熒光同步測量數(shù)據(jù)為例，結(jié)果表明大豆電子傳遞速率與碳同化兩者對(duì)光強(qiáng)的響應(yīng)一致性較好，同時(shí)達(dá)到最大值；而小麥的一致性相對(duì)較差，說明電子傳遞速率和碳同化并非完全一致，推測認(rèn)為有可能與作物對(duì)同化產(chǎn)物輸出的模式不同有關(guān)。通過光呼吸速率換算出的電子流(12×Rp)與實(shí)際測量電子流(ΔJO)之間存在較大的差異；另外，傳統(tǒng)方法估算出的光呼吸速率(估算值)與光呼吸測量值之間也存在較大差異，分析認(rèn)為這主要是由于絕對(duì)光合速率與相對(duì)電子傳遞速率之間差異造成。

氣體交換; 熒光; 電子流分配; 碳同化; 光呼吸; 光下暗呼吸

光合電子流分配是植物光合控制的一個(gè)重要環(huán)節(jié)[1]。植物光合電子流除參與碳同化和光呼吸外，還參與硝酸還原、草酰乙酸還原、Mehler反應(yīng)、圍繞PSⅠ的循環(huán)電子流等[2]。如果分配在光化學(xué)反應(yīng)上的光合電子流是一定的，不同電子流分配途徑之間便存在相互競爭，其中一條途徑對(duì)光合電子流的利用增加，其他途徑對(duì)光合電子流的利用就會(huì)相應(yīng)減少[3]。深入研究不同植物種類及其在不同環(huán)境條件下光合電子流傳遞分配規(guī)律將有助于闡明“光合控制”的特點(diǎn)、模式和機(jī)理[4]。

植物體內(nèi)發(fā)出的葉綠素?zé)晒庑盘?hào)包含了豐富的光合信息，可快速、靈敏和非破壞性的分析葉片光能的分配方向[5- 6]。20世紀(jì)90年代，Genty等[7]和Valentini等[8]研究表明，光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的電子傳遞效率(ΦPSⅡ)與光合電子流(Φe)成線性相關(guān)，光合電子流(Φe)又可通過無光呼吸的情況下CO2同化的表觀量子產(chǎn)量(ΦCO2)來估算，從而為氣體交換參數(shù)與熒光參數(shù)有機(jī)結(jié)合而深入探討光合過程提供了思路。目前，氣體交換和熒光同步測量在研究植物光能利用效率、碳同化和光抑制之間的關(guān)系等越來越受重視。Long等[9]通過葉片氣體交換和熒光同步測量提供了確定葉肉導(dǎo)度值的精確方法；Yin等[10]通過葉片氣體交換和熒光同步測量對(duì)光下暗呼吸等光合參數(shù)進(jìn)行了估算；康華靖等[11]對(duì)植物氣體交換和熒光測量數(shù)據(jù)擬合的方法進(jìn)行了比較研究，認(rèn)為利用植物葉片的氣體交換和熒光測量數(shù)據(jù)，再結(jié)合直角雙曲線修正模型擬合的方法可作為研究光合特性和光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)動(dòng)力學(xué)的一種有效手段。然而，將氣體交換和熒光參數(shù)結(jié)合而估算植物電子流分配的方法存在諸多問題，目前尚未引起人們的重視。為此，本文首先從生化過程對(duì)其缺陷進(jìn)行了論述，然后以小麥和大豆氣體交換與熒光同步測量數(shù)據(jù)為例進(jìn)行驗(yàn)證，旨在為植物光合電子流分配探討提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)于中國科學(xué)院禹城綜合試驗(yàn)站的試驗(yàn)田中進(jìn)行。小麥(Triticumaestivumcv. Z39- 118)和大豆(Glycinemax)種子分別播于2011年10月和2012年5月。常規(guī)管理。數(shù)據(jù)測量分別于2012年5月和6月進(jìn)行(均為晴天)。此時(shí)植株處于旺盛的營養(yǎng)生長期。隨機(jī)選取5至7株長勢較為一致的健壯植株，大豆挑選每株苗自下而上第5片復(fù)葉的頂葉作為測量對(duì)象，小麥選擇其旗葉作為測量對(duì)象。

不同氧濃度的控制為：2%O2為山東禹城新建氣體廠提供的混合氣體(2%O2和98%N2)。氣體通過減壓閥流入長2 m，寬1.5 m的密封的塑料緩沖袋，袋中注入少量自來水以保證氣體的相對(duì)濕度，最后通過進(jìn)氣管接入Li- 6400，以保證持續(xù)穩(wěn)定的低氧環(huán)境；大氣中的O2濃度視為21%。

1.2 數(shù)據(jù)測量

數(shù)據(jù)測量時(shí)，在自然光下誘導(dǎo)1.5—2 h后，采用開放式氣路，設(shè)定溫度為(30±1.3) ℃ (小麥)和(33±1.3) ℃ (大豆)，流速為400 μmol/s，空氣相對(duì)濕度控制在45%—70%，應(yīng)用CO2注入系統(tǒng)提供穩(wěn)定的CO2濃度(380 和0 μmol/mol)； Li- 6400- 40熒光探頭提供不同光合有效輻射強(qiáng)度(PAR)，分別為2000、1800、1600、1400、1200、1000、800、600、400、200、150、100、80、50、0 μmol m-2s-1，采用自動(dòng)測量程序(Flr Light curve)，同時(shí)記錄21%和2%O2濃度下葉片的氣體交換和葉綠素?zé)晒獾葏?shù)。每次記錄最小等待時(shí)間為2 min，最大等待時(shí)間為3 min，數(shù)據(jù)記錄之前儀器均自動(dòng)進(jìn)行參比室和樣品室之間的匹配。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

植物的光合作用對(duì)光的響應(yīng)曲線用直角雙曲線的修正模型擬合(以下簡稱直角雙曲線修正模型)[12- 13]。光呼吸速率(Rp)等于兩種O2濃度 (21%和2%)下表觀光合速率的差值。兩種O2濃度下的電子傳遞速率(ETR)之差為電子流降低(ΔJO)，即ΔJO=ETR21%-ETR2%。根據(jù)5至7株的測定數(shù)據(jù)(即5—7次重復(fù))，求其平均值。采用SPSS11.5進(jìn)行方差差異顯著性分析，Excel2010作圖。

2 模型分析

目前，國內(nèi)外關(guān)于光合電子流的計(jì)算主要采用Valentini等[8]和Epron等[14]所介紹的方法(簡稱傳統(tǒng)方法)：

JT=ETR=ΦPSⅡ×PAR×0.5×0.84

(1)

式中，PAR是光合有效輻射，ΦPSⅡ是PSⅡ的電子傳遞效率，由(Fm-Fs)/Fm計(jì)算而得[15,7]，0.84為葉片的光吸收系數(shù)[7,16]，0.5為光能在PSⅡ和PSI兩個(gè)光系統(tǒng)中分配的比例[17]。

其中光呼吸電子流分配(JO)和碳還原電子流分配(JC)的表達(dá)式分別為：

JO=4×(2×Rp)

(2)

JC=4×(A+Rd+Rp)

(3)

式中，A為表觀光合速率；Rd為光下暗呼吸速率；4為每同化1個(gè)CO2分子需要的電子數(shù)；2為每消耗2個(gè)O2分子釋放出一個(gè)CO2分子[18- 19]。

同時(shí)，傳統(tǒng)方法認(rèn)為植物葉片中來自PSⅡ的電子除了參與碳同化和光呼吸外，其他途徑可以忽略或至少為常數(shù)[8,14, 20]，即總電子流(JT)等于碳還原電子流分配(JC)和碳氧化(JO)所分配的電子流之和：

JT=JC+JO

(4)

據(jù)此，光呼吸速率(Rp)的估算表達(dá)式為：

Rp=[JT-4×(A+Rd)]/12

(5)

然而，該傳統(tǒng)方法存在的缺陷以下缺陷：首先，該方法只考慮了葉綠體內(nèi)的1,5-二磷酸核酮糖(RUBP)耗氧，而忽略了乙醇酸在過氧化物酶體中的耗氧。根據(jù)物質(zhì)守恒，可知C2氧化光合循環(huán)消耗3mol的氧分子(2mol在葉綠體中用于氧化RUBP，1mol在過氧化物酶體中)，最后在線粒體中釋放1mol CO2、消耗2mol還原力(2Fdred+2H+)，完成2-C骨架返回到卡爾文循環(huán)[21]。因此，光呼吸速率(Rp)與耗O2速率(Vo)的比例關(guān)系應(yīng)為：

Vo=3×Rp

(6)

光呼吸所分配的電子流(Jo)則為：

Jo=4×Vo=4×(3×Rp)=12×Rp

(7)

其次，植物葉片中來自PSⅡ的電子除了參與碳同化和光呼吸外，其他途徑所分配的電子流(Ja)，如氧的還原(Mehler反應(yīng))、氮代謝等途徑，不能忽略或者不為常數(shù)[22]，那么則有：

JT=JC+JO+Ja

(8)

另外，傳統(tǒng)方法中碳還原所分配的電子流(JC)以及光呼吸速率的計(jì)算均需用到參數(shù)——光下暗呼吸速率(Rd)。然而，目前關(guān)于光下暗呼吸速率的估算方法存在較大爭議，一些學(xué)者假設(shè)光下暗呼吸速率(Rd)不受光強(qiáng)或CO2濃度影響，而通過光響應(yīng)曲線[23]或者CO2響應(yīng)曲線[24]來估算；一些學(xué)者根據(jù)經(jīng)驗(yàn)值進(jìn)行換算[25]；一些學(xué)者將其等同于暗呼吸速率[26]。這均將嚴(yán)重影響碳還原電子流分配及光呼吸速率的準(zhǔn)確估算。

3 結(jié)果與討論

3.1 熒光光曲線

由圖1可知，直角雙曲線修正模型不僅可以很好地?cái)M合光響應(yīng)曲線，也可較好地?cái)M合快速光響應(yīng)曲線(圖1)。表1給出了擬合小麥和大豆的光響應(yīng)曲線、快速光曲線的擬合參數(shù)所得到的光合參數(shù)，以及這些光合參數(shù)相應(yīng)的測量值，其擬合值均與實(shí)測值較為一致。其中，由表觀光合速率和電子傳遞速率分別估算出的飽和光強(qiáng)，在大豆中分別為1938.11和1945.16 μmol m-2s-1，說明在大豆葉片中電子傳遞速率與碳同化兩者對(duì)于光強(qiáng)的響應(yīng)一致性較好；而在小麥中分別為2289.38 和1649.55 μmol m-2s-1，兩者之間差異顯著(P<0.05)，分析認(rèn)為有可能與作物對(duì)同化產(chǎn)物輸出的模式不同有關(guān)。

圖1 21% O2濃度小麥和大豆葉片光響應(yīng)曲線和快速光曲線Fig.1 Light response curve and Rapid light curve of photosynthesis for Soybean at 21%O2Pn為表觀光合速率，PAR為光合有效輻射，ETR為電子傳遞速率

表1 21% O2濃度下，小麥和大豆葉片的光響應(yīng)曲線與快速光曲線擬合參數(shù)Table 1 Fitted result of light response curves and Rapid light curves for Wheat and Soybean at 21% O2

所有的數(shù)均表示為平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差

3.2 光下暗呼吸速率(Rd)

光下，C3植物的碳代謝主要包括碳同化、光呼吸和暗呼吸。2%O2抑制了光呼吸，0 μmol/mol CO2則又抑制了光合碳同化(如果不考慮CO2的回收利用)，而此時(shí)暗呼吸可正常進(jìn)行[27]。因此，有光條件下，2%O2和0 μmol/mol CO2時(shí)的表觀光合速率可視為此時(shí)的光下暗呼吸速率(Rd)(圖2)。由圖2可知，0 μmol/mol CO2下，葉片的Rd隨著光強(qiáng)的升高而降低：從50 到2000 μmol m-2s-1，小麥的Rd從3.416 下降到2.230 μmolCO2m-2s-1(P<0.05)；而大豆的Rd則從 3.230 下降到1.861 μmol CO2m-2s-1(P<0.05)。

圖2 在2% O2和0 μmol/mol CO2條件下，小麥和大豆不同光強(qiáng)下的光下暗呼吸(Rd)Fig.2 The rate of mitochondrial respiration in the light (Rd) of wheat and beans response to PAR at 2% O2 and 0 μmol/mol CO2

目前，光下暗呼吸的估算主要有基于氣體交換數(shù)據(jù)測量的Kok[23]法和Laisk[24]法，也有結(jié)合葉綠素?zé)晒鈪?shù)對(duì)其進(jìn)行估算的報(bào)道[28]。然而，現(xiàn)有的估算方法均假設(shè)光下暗呼吸速率不受光強(qiáng)影響，并認(rèn)為光下暗呼吸速率小于其暗呼吸速率是由于光強(qiáng)抑制所致[29]。Tcherkez等[30]認(rèn)為抑制步驟有可能發(fā)生在己糖分子進(jìn)入糖酵解途徑和檸檬酸循環(huán)，但該抑制機(jī)理至今尚不清楚。然而本文的試驗(yàn)結(jié)果表明，0 μmol/mol CO2下的Rd隨著光強(qiáng)的變化而變化，這說明現(xiàn)有關(guān)于光下暗呼吸的估算方法均存在一定的缺陷。

另外，也有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明光下暗呼吸釋放的CO2大部分被光合作用直接回收利用，該回收利用的部分與釋放量之和接近暗呼吸速率，從而認(rèn)為光強(qiáng)并沒有抑制暗呼吸速率[31- 32]。由此可見，目前關(guān)于光下暗呼吸速率下降的原因及其準(zhǔn)確估算均尚無定論。這將嚴(yán)重影響光合電子流分配及光呼吸速率(公式3)等參數(shù)的計(jì)算。

3.3 光呼吸電子流分配

在C3植物中，光呼吸是非環(huán)式光合電子流分配的主要途徑[12]；特別在CO2限制的情況下，光呼吸能保持相當(dāng)?shù)木€性電子傳遞和光能利用[33]。因此，對(duì)光呼吸所分配電子流的定量研究對(duì)探討電子流的分配顯得尤為重要。比較公式(2)和(7)，可以看出傳統(tǒng)方法(8×Rp)低估了光呼吸所分配的電子流，從而低估了光呼吸對(duì)光合作用的保護(hù)作用。

圖3 兩種方法對(duì)小麥和大豆不同光強(qiáng)下光呼吸分配電子流(ETR)的計(jì)算結(jié)果比較Fig.3 The electron allocation of photorespiration of wheat and bean by two methods12×Rp為新思路下光呼吸所分配的電子流，8×Rp為傳統(tǒng)思路下光呼吸所分配的電子流，ΔJO為21%和2% O2下電子流之差

然而，根據(jù)光呼吸測量值計(jì)算出的光呼吸電子流(12×Rp)，與兩種氧濃度下的電子傳遞速率差值(ΔJO)存在較大差異(圖3)。另外，根據(jù)公式(5)計(jì)算出的光呼吸速率(估算值)與光呼吸測量值(即低氧法測量的光合速率差值)也存在較大差異：不同光強(qiáng)下小麥的光呼吸測量值顯著高于其估算值(P<0.05)；而大豆的光呼吸測量值在較低光強(qiáng)(<1000 μmol m-2s-1)下大于其估算值，在較高光強(qiáng)(≥1000 μmol m-2s-1)下則小于其估算值(圖4)。綜合圖3和圖4的試驗(yàn)結(jié)果，推測其原因是由于相對(duì)電子傳遞速率和絕對(duì)電子傳遞速率之間的差異造成。

圖4 傳統(tǒng)方法對(duì)小麥和大豆光呼吸速率(Rp)的估算結(jié)果(估算值)與低氧法測量值之間的比較Fig.4 Comparisons of photorespiration rate (Rp) of wheat and bean between estimated value and measured value

傳統(tǒng)儀器，如Li- 6400給出的電子傳遞速率是基于PAR擬合的(公式1)。PAR通常指400—700 nm的范圍，以μmol photons s-1m-2為單位[34]。Rappaport等[35]認(rèn)為該光強(qiáng)單位很少有實(shí)際的實(shí)驗(yàn)意義，因?yàn)槿绻恢罉悠返膶?shí)際吸收率就無法被可靠地轉(zhuǎn)換為光化學(xué)速率。因此，采用類似方法得到的是相對(duì)電子傳遞速率，與葉綠素含量無關(guān)，本質(zhì)上是在描述PSⅡ反應(yīng)中心電荷分離的相對(duì)頻率，而通過氣體交換參數(shù)換算而來的電子傳遞速率則為絕對(duì)電子傳遞速率。兩者在數(shù)量關(guān)系上勢必會(huì)存在差異。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過氣體交換算出的(12×Rp)絕對(duì)電子傳遞速率整體上大于Li- 6400測量出的相對(duì)電子傳遞速率(ΔJO)，如果光呼吸CO2存在回收利用，其差值還會(huì)更大。Schreiber等[36]以藻類為例的研究結(jié)果也顯示絕對(duì)電子傳遞速率遠(yuǎn)大于相對(duì)電子傳遞速率。

3.4 其他電子傳遞速率

植物的光合作用是光合能量和底物相互偶聯(lián)的氧化還原反應(yīng)[4]。光合電子流主要用于碳同化和光呼吸外，其他途徑分配的電子流是否為常數(shù)或者可以忽略目前尚存在爭議[2,22]。Edwards等[37]認(rèn)為氮代謝所需的能量非常小，而Turpin等[38]認(rèn)為植物的氮同化過程對(duì)ATP和NADPH 的需求量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于CO2的同化過程對(duì)它們的需求量。迄今為止，尚沒有建立一種絕對(duì)有效的定量方法來分析用于其他途徑的電子流分配。

總之，傳統(tǒng)計(jì)算電子流分配的方法主要存在以下問題：(1)低估了光呼吸每釋放一個(gè)CO2分子所消耗的電子數(shù)；(2)混淆了相對(duì)電子傳遞速率和絕對(duì)電子傳遞速率；(3)忽略了除碳同化和光呼吸外的其他電子流分配途徑；(4)難以準(zhǔn)確獲取光下暗呼吸速率值；另外，還存在氣體交換和葉綠素?zé)晒獾陌l(fā)生部位不一[39]、光合速率與電子傳遞速率并非完全同步等問題均影響基于氣體交換和熒光同步測量對(duì)光合電子流分配的準(zhǔn)確估算。因此，植物光合電子流分配的準(zhǔn)確估算尚需進(jìn)一步研究。

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Discussion on simultaneous measurements of leaf gas exchange and chlorophyll fluorescence for estimating photosynthetic electron allocation

KANG Huajing1,2,3,4, LI Hong4, TAO Yueliang5, ZHANG Haili4, QUAN Wei4, OUYANG Zhu1,2,3,*

1KeyLab.ofEcosystemNetworkObservationandModelingInstituteofGeographicSciencesandNaturalResourcesResearchChineseAcademyofSciences,Beijing100101,China2YuchengComprehensiveExp.StationChinaAcademyofScience,Beijing100101,China3ChinaGraduatesUniv.ofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China4WenzhouVocational&TechnicalCollege,Wenzhou325006,China5CollegeofLife&EnvironmentalScience,WenzhouUniversity,Wenzhou325026,China

The thylakoid electron (e-) transport chain in plant chloroplasts is pivotal in coordinating the fluctuating supply of absorbed light energy with the varying demands of the photosynthetic metabolism. Photosynthetic electron allocation plays a key role in regulation of the photosynthetic metabolic processes. However, according to the biochemical process, there are some deficiencies in the current method: (1) the electron number required for one oxygenation cycle was underestimated; (2) the relative electron transport rate and the absolute electron transport rate were confused; (3) some electronsviaPSⅡ were used to CO2assimilation and photorespiration, whereas others associated with electron-consuming processes (e.g. O2acceptor cycle or water-water cycle) were ignored; (4) mitochondrial respiration in the light (Rd) was difficult to obtain, which led to inaccurate estimation of carboxylative reaction electron flow (JC) and photorespiration rate (Rp). Simultaneous measurements of leaf gas exchange and chlorophyll fluorescence for wheat and bean were measured in this study. The results revealed that the electron transport rate and CO2assimilation synchronously reached the maximum values through fitting the rapid light curves and light response curve of plant photosynthesis in bean, but not in wheat. It′s concluded that the difference seemed to be attributed to assimilation product output pattern. The difference of the electron allocations between the calculated values from photorespiration rate (12×Rp) and the measured ones (ΔJO), and the difference of photorespiration rate between the estimation by traditional method (Eq.5) and the measurement, were all demonstrated that the difference between the relative electron transport rate and absolute electron transport rate.

gas exchange; fluorescence; electron allocation; carbon assimilation; photorespiration; mitochondrial respiration in the light

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目(2013AA102903); 中國科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所“一三五”戰(zhàn)略科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012ZD004); 浙江省教育廳項(xiàng)目(Y201327619)

2013- 04- 22;

日期:2014- 04- 03

10.5846/stxb201304220774

*通訊作者Corresponding author.E-mail: ouyz@igsnrr.ac.cn

康華靖, 李紅, 陶月良, 張海利，權(quán)偉, 歐陽竹.氣體交換與熒光同步測量估算植物光合電子流的分配.生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(4):1217- 1224.

Kang H J, Li H, Tao Y L, Zhang H L, Quan W, Ouyang Z.Discussion on simultaneous measurements of leaf gas exchange and chlorophyll fluorescence for estimating photosynthetic electron allocation .Acta Ecologica Sinica,2015,35(4):1217- 1224.