高遷移率族蛋白1在呼吸機相關性肺損傷大鼠中的表達變化

馬杰飛　何義舟　羅哲　屠國偉

(復旦大學附屬中山醫院重癥醫學科，上海　200032)

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·論著·

高遷移率族蛋白1在呼吸機相關性肺損傷大鼠中的表達變化

馬杰飛何義舟羅哲屠國偉

(復旦大學附屬中山醫院重癥醫學科，上海200032)

摘要目的：探討呼吸機相關性肺損傷(ventilator-induced lung injury， VILI)大鼠肺組織中高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1, HMGB1)的表達變化。方法： 將24只成年SD大鼠隨機分為3組，每組8只。對照組：自主呼吸；大潮氣量組：潮氣量(TV)=30 mL/kg；丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate, EP)干預組：尾靜脈注射EP(100 mg/kg)，機械通氣模式同大潮氣量組。采用Western blotting、RT-PCR、ELISA檢測大鼠血清、肺泡灌洗液、肺組織以及牽張24 h后肺泡巨噬細胞的培養液中的HMGB1以及炎性因子的水平。結果：大潮氣量組大鼠血清、肺泡灌洗液及肺組織中HMGB1含量較對照組增加。體外肺泡巨噬細胞培養液中的HMGB1在機械牽張的作用下也呈現上升趨勢。EP干預后，VILI大鼠肺組織中HMGB1減少，且細胞凋亡信號通路相關蛋白Caspase3、 Caspase9和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)表達增加。結論：VILI大鼠模型中HMGB1的表達增加，可能與肺泡巨噬細胞受機械牽張有關；EP干預對VILI肺組織有一定保護作用。

關鍵詞呼吸機相關性肺損傷；高遷移率族蛋白1；丙酮酸乙酯

基本項目：上海市衛生和計劃生育委員會基金項目(編號：201440333)復旦大學附屬中山醫院青年科學基金(編號：2013ZSQN/29)

呼吸機相關性肺損傷(ventilator-induced lung injury, VILI)是機械通氣(mechanical ventilation, MV)的嚴重并發癥[1-2]。最近研究[3]顯示，炎性反應在VILI發生發展過程中起著十分重要的作用。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein, HMGB1)是一類參與DNA重組修復的DNA結合蛋白，它作為炎性反應晚期介質，能夠調節其他炎性因子的分泌，在炎性反應中發揮重要作用[4]。但是HMGB1參與VILI發病的機制目前仍不明確，也未見將HMGB1作為靶點干預VILI的相關研究。我們通過研究VILI模型中HMGB1的表達變化、可能的機制及丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate, EP)對其的干預效果，企盼為VILI的發病機制和治療提供依據。

1資料與方法

1.1一般資料成年SD雄性大鼠24只，體質量200~250 g(上海市斯萊克實驗動物有限公司提供)。HMGB1(貨號：ab77302)抗體購自英國Abcam公司，GAPDH(貨號：G8795)抗體購自美國Sigma Aldrich公司；Caspase 3(貨號：9665)、Caspase9(貨號：9509)與PARP(貨號：5625)購自德國CST公司；ELISA試劑盒購自美國Millipore公司。PCR引物由上海Sagon公司合成。

1.2分組及模型構建將24只大鼠隨機分成3組，每組8只。對照組：保留自主呼吸；大潮氣量組：潮氣量(TV)=30 mL/kg，風險比(RR)=40次/min，吸呼比(I∶E)=1∶3，呼氣末正壓(PEEP)= 0，吸入氧濃度(FiO2)=21%；EP干預組：尾靜脈注射EP 100 mg/kg, 機械通氣模式同大潮氣量組。大潮氣量組和EP干預組大鼠在通氣期間每60 min將鼠臺向左或右傾斜，改變大鼠體位10~15 min，使肺各部位通氣均勻，整個過程中維持室溫26~28℃。實驗時按出血量和生理需要量維持補液(乳酸林格氏液，1 mL/kg)，定時加用麻醉藥和肌松藥。實驗結束后處死實驗鼠，再提取其肺組織及細胞，經HE染色檢測VILI模型是否構建成功。

1.3細胞機械牽張大鼠肺泡巨噬細胞培養于含有10%胎牛血清(FBS)、1% 青霉素-鏈霉素的DMEM培液中，細胞置于37℃，CO2體積分數為5%的環境中培養，待細胞貼壁生長至70%~80%融合后，進行機械牽張。機械牽張的拉伸應變率為20%，頻率為30次/min，牽拉/松弛力為1∶1，牽張24 h。隨后對細胞進行檢測，以未施加牽張應力的肺泡巨噬細胞為對照。

1.4標本采集及檢測

1.4.1血標本采集對照組于氣管切開30 min，自主通氣1、2、3、4 h，另兩組于機械通氣前、機械通氣1、2、3、4 h時，用肝素化的注射器經股動脈導管抽取0.2 mL全血，在室溫下行動脈血氣分析。實驗結束后經腹主動脈一次性抽取4 mL全血，于4℃、3000 r/min離心10 min后取上清液，置于-80℃凍存、待測。

1.4.2肺組織標本采集及制備機械通氣4 h后(對照組氣管切開4 h)，經動脈放血處死大鼠， 迅速打開胸腔并結扎右側主支氣管，取出右肺上葉置于4%中性甲醛中固定，然后取右肺下葉置于EP管中，-80℃凍存，用剩余右肺組織計算肺組織濕/干質量比(W/D)。取凍存的肺組織標本，用磷酸鹽溶液(PBS)沖洗3次，按照100 mg/mL的比例把肺組織置入PBS中，用電動勻漿機制成勻漿，以4℃、12000 r/min離心20 min后取上清液，置于-80℃凍存待測。

1.4.3蛋白及mRNA檢測采用Western blot ting法檢測肺組織和細胞中HMGB1等蛋白的表達，以GAPDH作為內參；用反轉錄PCR(RT-PCR)檢測肺組織和細胞中的mRNA含量，以GAPDH作為內參；用ELISA試劑盒檢測血清和細胞灌洗液中HMGB1的濃度。

2結果

2.1大鼠VILI模型的構建HE染色結果顯示，與對照組(圖1A)相比，大潮氣量組VILI大鼠模型肺部組織形態不規整，有較多破裂肺泡，并有的巨噬細胞浸潤(圖1B)。與對照組比較，大潮氣量組大鼠的肺泡灌洗液中的炎性因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-4(IL-4)、IL-6、IL-10、干擾素-γ(INF-γ)表達升高(圖1C)。上述結果表明，大鼠VILI模型構建成功。

2.2HMGB1在VILI模型中的表達變化與對照組比較，大潮氣量組大鼠的血清和肺泡灌洗液中HMGB1的mRNA或蛋白含量增加(圖1D、E、F)。

2.3機械牽張對肺泡巨噬細胞中HMGB1表達的影響對肺泡巨噬細胞施加20%牽張強度后，與未受牽張細胞相比，受機械牽張肺泡巨噬細胞的培養液中TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10增多(圖2A)，HMGB1蛋白表達增加(圖2B)。

2.4EP干預對VILI的影響肺組織HE與TUNEL染色顯示，EP干預后，肺泡形態較為規整，且細胞凋亡明顯增加(圖3A)；ELISA結果顯示，EP干預后，肺泡灌洗液中炎性因子表達減少(圖3B)。

2.5EP干預抑制HMGB1的表達并激活細胞凋亡信號通路EP干預后，肺組織HMGB1的表達減少(圖4A)，細胞凋亡信號通路的關鍵蛋白Caspase3、 Caspase9和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)蛋白的表達增加(圖4B)。

A：對照組肺組織HE染色結果；B：大潮氣量組肺組織HE染色結果；C、D：ELISA檢測結果；E：肺組織RT-PCR檢測結果；F：肺組織的Western blotting結果。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖1HMGB1在VILI大鼠模型中的表達變化

A：ELISA檢測結果；B：Western blotting 結果，與未牽張細胞比較，**P<0.01

圖2機械牽張對肺泡巨噬細胞HMGB1表達的影響

圖3　EP干預對VILI的影響

圖4　EP干預抑制HMGB1的表達并

3討論

巨噬細胞及炎性因子在VILI發生發展過程中發揮著重要作用。研究[5]發現，肺泡巨噬細胞在機械牽張早期即可被激活并成為炎性因子的主要來源。而本研究證實VILI模型大鼠血清和肺泡灌洗液中HMGB1含量增加，為了研究這種變化是否與由肺泡巨噬細胞受到機械牽張有關，我們構建了肺泡巨噬細胞機械牽張模型，結果表明肺泡巨噬細胞細胞表達的HMGB1、TNF-α、IL-4等炎性因子均增加，證實VILI中HMGB1的增加與肺泡巨噬細胞相關。

HMGB1是一種DNA結合蛋白，參與DNA的重組、修復等生命活動。1999年Wang等[6]首次報告，HMGB1作為一種晚期炎性介質參與了膿毒癥的發病過程，而后一系列的研究表明，HMGB1是嚴重感染所致多器官功能障礙綜合征(MODS)的重要炎性介質。有研究[4]指出，巨噬細胞、樹突狀細胞、垂體細胞、上皮細胞、肝細胞等受脂多糖(LPS)、INF-γ、生物活性脂等誘導后，胞內HMGB1可被主動分泌到細胞外。在機械通氣過程中，大潮氣量通氣、高氣道壓等損傷因素均可導致VILI的發生，而這些因素可直接損傷各種細胞或間接激活上皮細胞、內皮細胞或炎性細胞的細胞信號通路，造成各種細胞內介質的釋放，因而VILI其本質上來說也是一種炎性過程，而HMGB1作為一種炎性介質是否參與VILI的發生則需要進一步研究。本研究發現，VILI大鼠模型的肺泡灌洗液、血清及肺泡巨噬細胞培養液中HMGB1含量均上升，證實了上述假設。

美國食品和藥物管理局(FDA)已將EP列為安全藥物，并已通過臨床I期試驗，安全性和穩定性得到了肯定，目前II 期試驗正在進行中。本研究中，EP干預后，VILI大鼠肺泡形態及肺泡灌洗液中TNFα、IL-4等炎性因子減少，表明EP干預對VILI對肺部的炎性反應具有一定抑制效果。Ulloa等[7]發現EP可抑制BALB/c小鼠巨噬樣細胞RAW264.7株中TNFα和HMGB1的釋放。本研究發現，EP干預后，VILI大鼠肺組織中HMGB1的表達減少，并使一系列細胞凋亡信號通路中的關鍵蛋白升高，如Caspase3、Caspase9和PARP。因此，我們認為，EP干預對VILI具有保護作用。

綜上所述，VILI大鼠肺組織及血清中HMGB1的含量增加，說明機械牽張會促使肺泡巨噬細胞HMGB1的高表達并向外周組織釋放。EP干預可以明顯抑制VILI大鼠肺組織HMGB1的表達，并激活細胞凋亡通路，從而對VILI肺組織具有一定保護作用。HMGB1與EP的深入研究將為VILI的發病機制及治療提供新的方向。

參考文獻

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Study on the Expression of High Mobility Group Box-1 Protein in Rat Model of Ventilator-Induced Lung Injury

MAJiefeiHEYizhouLUOZheTUGuoweiDepartmentofCriticalCareMedicine,Zhongshanhospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective：To investigate the expression of high mobility group box-1 (HMGB1) in rat model of ventilator-induced lung injury (VILI). Methods: Twenty-four healthy adult SD rats were randomly divided into three groups, with 8 rats in each group.The control group: autonomous respiration.The large tidal volume group: tidal volume(TV)=30 mL/kg.The ethyl pyruvate(EP) intervention group:EP 100 mg/kg via the caudal vein and the same ventilation mode as the large tidal volume group.The levels of HMGB1 and inflammatory factors in serum and bronchoalveolar lavage fluid(BALF)and lung tissues, as well as in the culture medium of alveolar macrophages before and after mechanical stretching, were detected with Western blot-ting, RT-PCR and ELISA. Results: The levels of HMGB1 in serum, BALF and lung tissues of the large tidal volume group were higher than those of the control group. HMGB1 in the culture medium of alveolar macrophages was increased under mechanical stretching.The expression of HMGB1 decreased, and the proteins related to signal pathway of apoptosis as Caspase3, Caspase9 and PARP increased,in lung tissues of rat with VILI after EP intervention. Conclusions: The expression of HMGB1 increases in rat model of VILI, which may be related with the effect of mechanical stretching on alveolar macrophages. EP intervention had certain protective effect on lung tissues with VILI.

Key WordsVentilator-induced lung injury；High mobility group box-1 protein；Ethyl pyruvate

通訊作者屠國偉，E-mail: tu.guowei@zs-hospital.sh.cn

中圖分類號R363.15

文獻標識碼A