膠體金免疫層析法快速檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中的大腸O157:H7

馬麗萍，袁曉紅，付曉陸，胡津津，陸軍良，申屠琰，朱波瑩，陳璐瑤

(1.余姚市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，浙江余姚 3 15400;2.余姚市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)總站，浙江余姚 3 15400;3.余姚市水產(chǎn)技術(shù)推廣中心，浙江余姚 3 15400)

腸出血性大腸埃希氏桿菌是一種新的危險(xiǎn)的食源性致病菌。其主要血清型是O157:H7，主要通過(guò)受污染的牛肉、牛奶及其制品等引起食物中毒［1］。目前腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7的常用檢測(cè)方法包括傳統(tǒng)平板分離培養(yǎng)和生理生化鑒別、ELISA、PCR及熒光定量 PCR等方法［2-3］。PCR檢測(cè)敏感性高，特異性強(qiáng)，但需要特殊的儀器設(shè)備。利用膠體金檢測(cè)試紙條穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)便快速，結(jié)果易于分析判定。

1 材料與方法

1.1 材料

抽取的樣本含187份果蔬，26份生肉制品，36份水產(chǎn)。

EC肉湯等培養(yǎng)基購(gòu)于北京路橋技術(shù)責(zé)任有限公司，CT-SMAC、改良山梨醇麥康凱瓊脂添加劑購(gòu)于青島海博，O157顯色培養(yǎng)基購(gòu)于科馬嘉公司，O157膠體金試紙條購(gòu)于上海慧蕓生物科技有限公司。

1.2 金膠速測(cè)方法

將25 g樣品接種于225 mL EC肉湯， (36±1)℃培養(yǎng)24 h，取100μL樣品增菌液加入微孔板中，再加入100μL增敏液制成待測(cè)液，混勻，將測(cè)試條放入，2 min內(nèi)觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈敏度測(cè)定

該試紙條對(duì)E.coli O157:H7純菌液檢測(cè)的靈敏度為106mL-1(圖1)。

圖1 E.coli O157:H7膠體金免疫層析法快速檢測(cè)的靈敏度

2.2 交叉反應(yīng)

交叉反應(yīng)結(jié)果列表1。

表1 E.coli O157:H7膠體金試紙條與各標(biāo)準(zhǔn)菌株的交叉反應(yīng)

2.3 有效期

取生產(chǎn)期為半年的層析條置37℃培養(yǎng)箱中，每隔3 d取出2條，分別檢測(cè)陽(yáng)性樣品和空白對(duì)照。21 d后，檢測(cè)結(jié)果與4℃低溫存放的層析條無(wú)異。6個(gè)月、1年后，再重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果無(wú)異。

2.4 國(guó)標(biāo)比對(duì)

用金膠試紙條法和國(guó)標(biāo)GBT 4789.36—2008大腸埃希氏菌O157:H7NM中第一法檢驗(yàn)比較，289份待測(cè)樣本中，國(guó)標(biāo)全部陰性，膠體金試紙條有6個(gè)樣品顯示弱陽(yáng)性，符合率為97.9%(圖2)。2.5 生化鑒定比較

圖2 樣品中呈陽(yáng)性和陰性的試紙條

對(duì)6個(gè)膠體金檢測(cè)呈弱陽(yáng)性的樣本，吸取增菌液1μL，進(jìn)行涂布培養(yǎng)。進(jìn)一步生化鑒定，挑取分離平板上的可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂和葡萄糖半固體各1管，經(jīng)37℃培養(yǎng)18～24 h。6個(gè)樣本呈現(xiàn)如下特征:a.產(chǎn)生硫化氫的培養(yǎng)物;b.在18～24 h內(nèi)發(fā)酵乳糖、蔗糖的培養(yǎng)物;c.不分解葡萄糖、乳糖、蔗糖的培養(yǎng)物;d.斜面和底層均呈黃色的培養(yǎng)物;e.斜面和底層均呈黃色有動(dòng)力的培養(yǎng)物;f.在三糖鐵瓊脂斜面上呈蔓延生長(zhǎng)的培養(yǎng)物。

對(duì)于三糖鐵上的菌落做常規(guī)革蘭氏染色后鏡檢，并做氧化酶試驗(yàn)，同時(shí)用O157標(biāo)準(zhǔn)菌株參考做對(duì)照，結(jié)果6株菌株革蘭氏染色均為陰性，剔除產(chǎn)硫化氫的菌落，并作血清學(xué)試驗(yàn)，5株菌株血清不凝集。用API20E生化鑒定試劑盒，按照使用說(shuō)明進(jìn)行，上機(jī)ATB，生化反應(yīng)見(jiàn)表2。

1-5號(hào)菌株經(jīng) ATB鑒定，分別為91.2%，95%，80%，93%，70%的大腸桿菌，并留樣送其他實(shí)驗(yàn)室做相關(guān)PCR檢測(cè)，結(jié)果一致。

表2 部分生化指標(biāo)鑒定結(jié)果

3 小結(jié)和討論

免疫層析法結(jié)合了酶聯(lián)免疫和色譜層析的優(yōu)點(diǎn)，抗原抗體特異性結(jié)合保證了其特異性，而其原理又決定具有更高的靈敏度［2］。因此，該膠體金的靈敏度測(cè)試和交叉反應(yīng)結(jié)果均較好。

通過(guò)膠體金試紙條檢出假陽(yáng)性的6個(gè)樣本，通過(guò)后期確認(rèn)，分別為白蘿卜2個(gè)、胡蘿卜2個(gè)、芋艿和洋芋各1個(gè)，均為土壤接觸面比較大的蔬菜，不排除土壤中的真菌和其他未知菌的協(xié)同作用結(jié)果。而大腸桿菌屬于腸桿菌科埃希氏菌屬，不同菌株間DNA相關(guān)性為80%［3］，這也和生化試驗(yàn)中，檢測(cè)出5株干擾菌均為大腸桿菌的結(jié)論相吻合。

另外，在對(duì)249份農(nóng)產(chǎn)品的抽檢過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，雖然并未檢出目標(biāo)菌為大腸桿菌O157:H7，但通過(guò)顯色培養(yǎng)基，選擇性培養(yǎng)基上挑出的其他可疑菌落，檢出金黃色葡萄球菌3株，阪崎腸桿菌1株，這些都是國(guó)標(biāo)中規(guī)定不得檢出的致病菌。因此建議農(nóng)產(chǎn)品應(yīng)盡量避免生食，以避免食源性致病菌污染，從而避免爆發(fā)群體性食物中毒事件發(fā)生。

在試驗(yàn)基礎(chǔ)上，與生產(chǎn)廠家進(jìn)行溝通，廠家正根據(jù)分離出的干擾菌進(jìn)行PCR檢測(cè)，為推出準(zhǔn)確度更高的新型試紙條做理論基礎(chǔ)。今后農(nóng)產(chǎn)品致病菌快速檢測(cè)將會(huì)朝著國(guó)產(chǎn)化的道路越走越寬，為縮短檢測(cè)時(shí)間帶來(lái)巨大影響。

［1］ 季曉輝.腸出血性大腸埃希氏桿菌的鑒定與檢測(cè)［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)，1997(3):174-177.

［2］ 王中民，李君文，王新為，等.膠體金免疫層析法快速檢測(cè)沙門氏菌［J］.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2004，32(4):36-38.

［3］ 王海艷，劉虹，劉中學(xué)，等.菌落粗糙型大腸桿菌的分離與鑒定 ［J］.檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2006，16(6):8-10.