TBPA氣相暴露對肺毒性的研究

龍金烈，黃長江

(溫州醫科大學環境安全與健康風險評估研究院，浙江溫州 3 25035)

四溴雙酚A(TBBPA)是目前全球生產量和使用量最大的溴代阻燃劑之一［1］，被廣泛用于電器、各種電子設備、紡織品、家具等日常商品中，無論是反應型還是添加型產品都會將TBBPA及其代謝物釋放到環境 (土壤、沉積物、水體和大氣)中去，并在相應的介質中檢測出［2］。TBBPA性質會隨著外界環境的改變而產生變化，如當pH值升高時，可增加TBBPA的溶解性和遷移能力［3］。據日本相關報道，TBBPA在土壤和沉積物中的濃度范圍分別為0.5～140μg·kg-1(干重)和2～150μg·kg-1(干重)［4-5］，在電器回收廠的室內氣體可檢測出TBBPA［6］，生產地附近空氣可檢測出TBBPA，其中的濃度約1.8 μg·m-3［7］，根據資料表明，我國青島和珠江三角洲近岸海域底泥中均檢測到TBBPA［8］，在我國廣東貴嶼某電子垃圾拆解點附近大氣中TBBPA的濃度范圍為66.01～95.04 ng·m-3，上海和臺州典型電子廢棄物拆解場地、廢棄電視機拆解廠中，TBBPA在人工拆解的廢棄物中的含量為557 ng·g-1，灰塵中TBBPA的含量與材料中的濃度分布密切相關［9］。有關TBBPA毒性作用研究報道不少，如:肺組織免疫作用的改變［10］、內分泌干擾效應［11-12］、生殖［13］及肝腎毒性［14］等等，但關于TBBPA的氣相暴露對肺毒性的研究，至今國內外尚未見相關報道。目前認為空氣顆粒物(particulate matter，PM)污染與呼吸系統疾病如哮喘、肺癌等密切相關，粒徑＜2.5μm的PM進入肺后可與肺泡巨噬細胞、肺上皮細胞作用，刺激釋放各種細胞因子，導致肺炎癥和肺纖維化［15］。本研究通過模擬浙江臺州地區電子垃圾拆卸地附近的空氣PM中TBBPA的含量并以小鼠作為模型進行肺毒性相關研究，為評估電子廢棄物拆解回收的環境風險及采取相應改善措施提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

氣相暴毒柜 (天津合普公司)，臺式低溫高速離心機、微量移液器及QPCR儀器 (5417R，德國Eppendorf公司)，超純水器 (UPWS-1-20T，杭州永潔達凈化科技有限公司)，精密電子天平(Satorius BS124S，北京賽多利斯儀器系統有限公司)，顯微鏡 (Olympus CX31RTSF，Japan)，24孔無菌細胞培養板及1.5 mL離心管 (碧云天生物技術研究所)，-80℃超低溫冰箱 (美國 Thermo Forma公司)。

供試試劑有DMSO(廣東省化學試劑工程技術研究開發中心)，TBBPA(Sigma-Aldrich，USA)，MDA、BCA總蛋白測定試劑盒、T-AOC、LDH(乳酸脫氫酶)、PBS緩沖液、灌胃針 (碧云天生物技術研究所)，瑞氏染液 (珠海貝索生物技術有限公司)、QPCR試劑 (大連寶生物工程有限公司)。

供試動物為8周齡雄性ICR小鼠 (購于溫州醫科大學實驗動物中心)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠染毒方法

將8周齡ICR雄性小鼠隨機分為4組(DMSO，DMSO+0.1μg·m-3TBBPA，DMSO+1 μg·m-3TBBPA，DMSO+10 μg·m-3TBBPA)，放入染毒柜子中連續染毒2個月，每天染毒8 h，上午4 h，下午4 h，中午取出喂食2 h。

1.2.2 肺灌洗液的取樣、細胞計數及分類

用灌胃針吸取無鈣、鎂離子中性PBS灌洗肺組織5次，每次量均為1 mL，每次吸取的灌洗液分別放在按號碼標記的EP管中，抽取的灌洗液均放置于冰上，第1管上清吸取后保存于-80℃，用于炎癥因子、蛋白等的測定。其余4管上清棄掉，保存下來的細胞與第1管的細胞沉淀混合在一起4℃ 300 r·min-1離心4 min，棄掉上清后，向沉淀里加入100μL的無鈣、鎂離子中性PBS中混勻，用于細胞的總數的計數，計數完之后再4℃300 r·min-1離心4 min，棄掉上清，向沉淀里加入20μL的無鈣、鎂離子中性PBS重懸混勻，接著涂片、晾干、用瑞氏染色液 A液染30 s，B液染1 min，油鏡下每個標本計數200個白細胞并進行分類計數。

1.2.3 引物的設計

引物的設計用primer premier 5.0軟件與NCBI在線驗證相結合，具體引物見表1。

表1 基因上下游的引物

2 結果與分析

2.1 氣相TBBPA對小鼠肺灌洗液的影響

圖1所示，與對照組相比，TBBPA處理組灌洗液中白細胞總數、巨噬細胞數及多形核白細胞數(polymorphonucleocytes，PMNs)均升高，1μg·m-3組的細胞總數升高顯著 (P ＜0.05)，1μg·m-3組 (P ＜ 0.01)及10μg·m-3組 (P ＜0.05)的PMNs升高明顯，對巨噬細胞數的影響未見統計學差異。

圖1 小鼠肺灌洗液中的相關指標

TBBPA處理組灌洗液中總蛋白含量、ALP及LDH活性較對照組均升高，10μg·m-3組總蛋白含量升高較為明顯 (P ＜0.05)，1μg·m-3組ALP活性升高明顯 (P＜0.05)。

2.2 氣相TBBPA對小鼠肺組織的影響

如圖2所示，處理組雙肺臟器系數均不同升高，但未見統計學差異;TBBPA處理組肺總SOD活性升高，1μg·m-3組升高趨勢相對較大，但均未見統計學差異;1μg·m-3及10μg·m-3處理組肺MDA含量升高，而0.1μg·m-3組降低，均未見統計學差異;TBBPA處理組肺 TAOC降低，1μg·m-3組降低趨勢相對較大，但均未見統計學差異。

圖2 小鼠肺組織的相關指標

2.3 氣相TBBPA對小鼠肺組織相關基因的影響

如圖3所示，與對照組相比，TBBPA處理組肺組織SP-A、SP-B、SP-D、CCSP、Cyp1A1基因表達均有上調趨勢，其中，1μg·m-3(P ＜0.01)及10μg·m-3組 (P ＜0.05)的 SP-B上調顯著，1μg·m-3(P ＜0.05)的SP-D上調顯著，10μg·m-3組的CCSP上調顯著 (P ＜0.05)。

3 小結與討論

TBBPA氣相暴露可引起肺組織氧化應激作用及炎癥反應。研究表明，許多污染物發揮毒作用的重要環節之一是氧化應激［16］，李亞寧等［17］研究表明TBBPA對顫蚓具有氧化脅迫作用，包括引起SOD、CAT、GST活性的變化，本研究顯示，處理組中肺組織總SOD有升高趨勢，TAOC有降低趨勢，MDA有升高趨勢，可能是由于TBBPA的氣相暴露引起了氧化脅迫作用并伴隨有脂質過氧化物的堆積。另外，處理組肺灌洗液中總細胞數、巨噬細胞數及PMNs數增加，說明TBBPA的氣相暴露引起了小鼠的氣道炎癥反應。TBBPA的毒性與文獻的報道一致，但是，本研究做的是氣相TBBPA毒性機制研究，在我國空氣污染嚴峻的今天，氣相TBBPA的毒性機制研究似乎更有實際意義。

圖3 小鼠肺組織相關基因表達情況

TBBPA氣相暴露可引起肺組織細胞膜損傷。TBBPA暴露后測定小鼠肺灌洗液中總蛋白及ALP發現這些值均升高，說明氣相TBBPA暴露后引起了肺組織細胞膜的損傷，從而使總蛋白及ALP從細胞內漏出至胞外。

TBBPA氣相暴露影響肺上皮細胞結構和代謝并激發自身的免疫保護作用。通常認為肺泡上皮由Ⅰ和Ⅱ型肺泡上皮細胞構成，在肺損傷修復過程中，Ⅱ型肺泡上皮細胞可以轉變為Ⅰ型肺泡上皮細胞［18］，肺表面活性物質 (PS)是由Ⅱ型肺泡上皮細胞分泌的二棕櫚酰卵磷脂等磷脂成分構成，有維持肺泡形態的功能 (降低肺泡表面氣-液表面張力、防止吸氣時肺泡過度膨脹、呼氣時肺泡過度塌陷等)。10%的PS由4種表面活性蛋白構成，即SP-A、SP-B、SP-C、SP-D。SP-A及SP-D是親水性蛋白，與PS的代謝及結構有關，主要功能為參與肺部固有免疫，SP-B及SP-C為疏水性蛋白，能降低肺泡氣液界面的表面張力［19］。本研究通過QPCR實驗發現:與對照組相比，處理組肺組織SP-B及SP-D基因上調，說明TBBPA氣相暴露肺泡上皮細胞結構和代謝的改變，并激發了自身的免疫功能，達到機體自身保護的目的。

TBBPA氣相暴露可激發自身抗炎及抗纖維化作用。Lesur等研究發現特發性肺纖維化患者肺泡液中的CCSP較對照組的低［20］，大鼠肺間質纖維化CCSP陽性細胞較對照組明顯減少［21］，上述研究結果均表明CCSP具有抗纖維化作用。本研究通過QPCR實驗發現:與對照組相比，處理組肺組織CCSP較對照組上調。說明TBBPA氣相暴露激發自身了機體抗炎及抗纖維化作用。

TBBPA氣相暴露可激發肺組織自身代謝功能。通常認為，細胞色素P450是重要的參與藥物水解、還原、氧化的I相反應代謝酶，使所催化的藥物極性增大，利于與Ⅱ相反應中與內源性小分子(如乙酰基、谷胱甘肽、葡萄糖醛酸)結合，從膽汁和腎臟排出。目前，發現哺乳動物存在14個P450基因家族，26個基因亞家族，CYP1家族基因定位于第15號染色體上，包括 Cyp1A1和Cyp1A2。本研究通過QPCR實驗發現:與對照組相比，處理組肺組織Cyp1A1較對照有上調趨勢。有可能肺組織中的Cyp1A1基因參與了由于氣相暴毒而進入肺內的TBBPA的代謝作用，利于后者的排出。

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