凝結芽孢桿菌的篩選、鑒定及抑菌特性的初步研究

姚曉紅，吳逸飛，楊家帥，柳 永 ，王 新 ，湯江武*

(1.浙江省農業科學院植物保護與微生物研究所，浙江杭州 3 10021;2.杭州科皇飼料有限公司，浙江杭州 3 1115)

由于耐藥性問題，抗生素在飼料中的應用受到嚴格限制。而益生菌是一類通過調控動物腸道微生物區系的平衡，從而有效促進宿主動物健康和生長的微生物活菌制劑，且對動物和人無毒副作用。目前常用的益生菌主要有乳酸菌、芽孢桿菌等。乳酸菌作為益生菌株應用于畜禽養殖已有多年歷史，但其抗逆性較差，不耐熱，在飼料加工過程中損失較大。因此，產乳酸的芽孢桿菌成為近年乳酸菌研究的熱點。早在1989年，美國FDA公布的41種可用于飼料的安全菌株及1992年再次批準的42種安全蓖株中，包括5種芽孢桿菌，凝結芽孢桿菌(Bacallus coagulans)排在第1位。凝結芽孢桿菌除具有乳酸菌和雙歧桿菌等益生功效外，還兼具有耐高溫、耐酸和耐膽鹽等高抗逆性，故其作為一種新型益生菌而日益為人們所重視［1］，是近年研究較為熱門的益生菌種。

研究表明，凝結芽孢桿菌應用于生長肥育豬飼料中，可顯著提高豬的平均日增重，降低飼料成本，還可使糞便臭味降低，改善豬舍的飼養環境［2］。國內外研究證明，服用凝結芽孢桿菌活菌能降低腸道pH值，減少臭氣，同時能顯著增加腸道內雙歧桿菌的數量［3-4］。在此背景下，本試驗嘗試從斷奶仔豬腸道內容物樣品、菜園土壤、泡菜等多種微生物來源中分離耐膽鹽和低pH的凝結芽孢桿菌菌株，并對其抑菌特性進行研究，以期為后期的生產應用提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 分離及篩選菌種培養基

培養基配方參照文獻 ［5］。

改良 MRS培養基。蛋白質10.0 g，牛肉膏10.0 g，檸檬酸氫二鈉2.0 g、無水乙酸鈉5.0 g，酵母膏5.0 g，葡萄糖5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，吐溫-80 1.0 mL，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，水1 000 mL，調pH值6.2～6.5，115℃滅菌20 min。

乳酸菌增殖培養基 (YPG培養基)。葡萄糖5.0 g，蛋白質5.0 g，酵母提取物1.0 g，CaCl20.10 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，調pH 6.8～7.0，115℃滅菌20 min。

1.2 菌株篩選方法

1.2.1 平板初篩

將采集的土樣、畜禽腸道內容物等樣品接入改良的MRS培養基中，37℃下靜置培養，再將富集好的樣品轉入乳酸菌增殖培養基平板中，37℃恒溫培養24 h，待菌落長出，挑取具有溶鈣圈的單菌落，反復劃線分離至獲得純菌株。

1.2.2 菌株產酸能力測定方法

根據EDTA螯合Ca離子測定乳酸的方法和總酸度的測定方案原理基本相同的原理，考慮初篩的快速性要求。試驗采用pH計直接測定培養48 h后培養基中pH值來表示菌株產酸能力的強弱。

1.2.3 膽鹽耐受和低pH耐受檢測

取10支裝有10 mL乳酸菌增殖培養基的液體試管，分別調整pH至3.0，另取10支裝有10 mL乳酸菌增殖培養基的液體試管，分別加入終濃度為0.03%的牛膽鹽，均接入1%的初篩菌種，于37℃下培養24 h，以不調整pH和不添加膽鹽的試管作對照，于D600下檢測吸光度。

1.3 抑菌效果試驗

1.3.1 平板抑菌試驗

采用瓊脂擴散法對篩選獲得的凝結芽孢菌進行致病菌的抑制試驗［6］。將凝結芽胞桿菌活化2～3代，10 000 r·min-1離心收集上清，制備菌種上清液。

指示菌的準備。將枯草芽孢桿菌、啤酒酵母、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌活化2～3代后，將菌液濃度用無菌水調整至107mL-1，取1 mL菌液加入培養皿中，用LB培養基或PDA培養基傾注平板，待完全凝固后，每平板上放入牛津杯若干，在每個牛津杯中加入200μL的上清液，以空白MRS培養基為陰性對照，檢測加入培養上清液對指示菌的抑菌作用。

1.3.2 液體共培養試驗

將復篩獲得的凝結芽孢桿菌菌種與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等致病菌在LB培養基中共培養24 h后涂布平板，檢測凝結芽孢桿菌與指示菌的活菌數，以此反映凝結芽孢桿菌的抑菌活性。

1.4 菌株鑒定

參照《常見細菌系統鑒定手冊》［7］及《微生物學試驗教程》［8］進行接觸酶檢測、厭氧生長檢測、50℃生長檢測和7%NaCl生長檢測，之后再進行一系列的驗證檢測，包括糖、醇發酵、運動性檢測、淀粉水解試驗、卵黃反應、酪素水解生長溫度檢測和耐熱性檢測。分子生物學鑒定包括染色體DNA的提取、菌株16S rDNA的擴增克隆及序列測定及BLAST比對，均參照文獻 ［9］。

2 結果與分析

2.1 凝結芽孢桿菌初篩

以平板透明圈直徑為指標，對不同來源的乳酸菌進行初篩 (表1)，選取溶鈣圈大的菌株進入下一步試驗。本次篩選總共得到相關菌種35株，根據凝結芽孢桿菌的形態特點，選定菌株JA等16株呈桿狀的乳酸菌進入復篩。

表1 菌種的初步篩選結果

2.2 凝結芽孢桿菌的復篩

2.2.1 YPG液體培養基中pH值的測定

表2表明，菌株E5等9株桿狀乳酸菌的產酸能力較強，故選這9株菌進行后續膽鹽耐受能力和低pH值耐受性的檢測。

2.2.2 膽鹽和低pH值的耐受性

多種試驗結果證明，菌株在腸道中定植的前提是能夠耐受胃部pH 3.0左右的考驗和小腸中膽汁鹽對細菌的殺滅作用。為考察經過復篩9株菌的膽鹽和pH值的耐受性，試驗采用液體試管培養基的方法，以培養24 h的菌體濃度為指標，篩選耐受膽鹽和低pH值的菌株 (表3)。

表2 初篩菌株在液體培養基上產酸能力

表3 膽鹽耐受和低pH值試驗結果

由表3可知，BFS-2，B4，NJ受膽鹽的毒害作用較小，受pH值影響也較其他菌株低。綜合考慮，選取B4，BFS-2，NJ進行抑菌效果試驗。

2.3 凝結芽孢桿菌抑菌試驗

2.3.1 平板抑菌試驗

試驗表明，所篩選的3株凝結芽孢桿菌對大腸桿菌、啤酒酵母、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等4株指示菌均有一定的抑制作用。

由表4可知，3種凝結芽孢桿菌的抑制效果均較差，但對大腸桿菌等腸道條件致病菌的抑制情況較好，其中綜合效果最好的菌株為BFS-2。

表4 抑菌試驗結果

2.3.2 液體共培養抑菌試驗

由表5可知，在0～12 h時，大腸桿菌和凝結芽孢桿菌都有生長，菌數上升，這是由于新投入的菌體還未完全啟動生長過程，特別是生長相對較慢的凝結芽孢桿菌。因此，大腸桿菌在剛投加時，菌數上升明顯;但24 h之后，大腸桿菌的菌數下降明顯，而凝結芽孢桿菌的菌數繼續上升，并在36 h達到最高。其后，由于培養液pH值的降低，而表現為菌數的下降和菌體的自溶。

表5 液體抑菌試驗結果 (共培養)

2.4 菌種鑒定

2.4.1 形態學鑒定

菌株BFS-2接種在培養基中于37℃培養24 h后，顯微鏡下觀察其特征。結果表明，菌株BFS-2的單菌落呈圓形，不透明，突起邊緣整齊;革蘭氏染色呈陽性，細胞呈桿狀且可形成端生橢圓形芽孢，芽孢囊不明顯膨大，且接觸酶陽性，初步可判斷該菌株屬于芽孢桿菌屬。

2.4.2 生理生化特征鑒定

表6可知，菌株BFS-2革蘭氏染色陽性，可運動，接觸酶反應陽性，可在高溫下生長，且可發酵多種糖類產酸，因而確定屬于芽孢桿菌屬細菌。

表6 菌株生理生化鑒定結果

2.4.3 分子鑒定

測得BFS-2菌株16SrDNA部分序列1 464 bp，該序列BLASTn比對結果與芽孢桿菌屬的16S rDNA序列高度相似，相似度達99%。結合生理生化結果，并參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》進行分析后，確定菌株BFS-2為凝結芽孢桿菌。

3 小結與討論

從斷奶仔豬腸道、菜園土壤、泡菜等不同來源樣品中分離乳酸菌，通過一系列的功能性評價試驗，篩選出1株對低pH和膽鹽耐受性強，并對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌效果的菌株BFS-2。經鑒定該菌株為凝結芽孢桿菌。研究表明，微生態制劑不但能提高機體的生長性能［10］，而且還能降低腸桿菌科細菌在胃腸道各部位定植水平，從而影響腸道菌群的微生態平衡［11］。

凝結芽孢桿菌的益生作用在國外早已證明。Adami等［12-13］給仔豬飼喂凝結芽孢桿菌后，可顯著降低仔豬死亡率，提高飼料轉化率，仔豬糞便中腸球菌和大腸桿菌數量明顯降低。我國關于乳酸芽孢桿菌微生態制劑的相關報道較少。

本試驗采用營養培養基從斷奶仔豬腸道、菜園土壤、泡菜等不同來源樣品中分離獲得乳酸菌35株，根據凝結芽孢桿菌的形態特征，及其產酸能力的大小，將產酸能力強的9株菌進行膽鹽耐受性和低pH耐受性試驗，獲得3株耐受性強的菌株，其中菌株BFS-2對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌效果。經生理生化及分子測序分析，鑒定菌株BFS-2為凝結芽孢桿菌。凝結芽孢桿菌是近年來益生菌領域的后起之秀，其除具有乳酸菌和雙歧桿菌等保健功效外，還具有耐高溫、耐酸和耐膽鹽等高抗逆性［14］，其作為一種新型益生菌正日益被人們所重視。本文篩選獲得1株耐低pH和膽鹽，并具有較好的抑菌效果的凝結芽孢桿菌BFS-2，在飼料工業和養殖中具有潛在的應用和開發前景。

［1］ 季奎文，呂學敏.新型動物益生素凝結芽孢桿菌的開發與應用 ［J］.天津科技，2005(4):50-51.

［2］ 吳建忠，杜冰.乳酸芽孢桿菌制劑對仔豬黃白痢的預防［J］.安徽農業科學，2007，35(13):3869，3948.

［3］ 崔云龍，萬阜昌，李長齡，等.凝結芽孢桿菌 (TBC169)片治療便秘的實驗研究和臨床療效［J］.中國微生態學雜志，2006，18(4):264-269.

［4］ Katsutoshia，Shinichim，Tadasih，et al.Effect spore-bearing lactic acid-forming bacteria(Bacillus coagulans SANK70258)administration on the intestinal environment，defecation frequency，fecal characteristics and dermal characteristics in humans and rats［J］.Microb Ecol in Health Dis，2003，14(1):4-13.

［5］ 凌代文.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法［M］.北京:中國輕工業出版社，1999.

［6］ 呂燕妮.戊糖乳桿菌31-1菌株產細菌素研究 ［D］.北京:中國農業大學，2004.

［7］ 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊 ［M］.北京:科學出版社，2001:62-65.

［8］ 楊革.微生物學實驗教程［M］.北京:科學出版社，2004.

［9］ 周琳，張杰.群落分析中的16S rRNA及其基因16S rDNA優化擴增［J］.微生物學報，2010，50(1):7-14.

［10］ Geary T M，Brooks P H，Morgan T，et al.Performance of wearer pigs fed ad labium with liquid feed at different dry matter concentrations［J］.J Sci Food Agric，1996，72:17-24.

［11］ Vanwinsen R L，Purling B A，Lipman L A，et al.Effect of fermented feed on the microbial population of the gastrointestinal tracts of Pigs ［J］.Applied and Environment Microbiology，2001，67(7):3071-3076.

［12］ Adami A，Sandrucci A，Cavazzoni V.Pigletsfed from birth with the probiotic Bacillus coagulans as additive:Zootechnical and microbiological aspects ［J］.Ann Microbiol Enzimol，1997，47:139-149.

［13］ Adami A，Cavazzoni V.Occurrence of selected bacterial group in the faeces of piglets fed with Bacillus coagulans as probiotic［J］.JBasic Microbiol，1999，39(1):3-9.

［14］ 董惠鈞，姜俊云，鄭立軍，等.新型微生態益生菌凝結芽孢桿菌研究進展［J］.食品科學，2010(1):292-294.