不同缺氧條件對小鼠骨髓基質細胞成分組成和細胞分化的影響

任紅英，趙欽軍，王彤，程雪蓮，程濤(中國醫學科學院血液學研究所，實驗血液學國家重點實驗室，天津300020)

不同缺氧條件對小鼠骨髓基質細胞成分組成和細胞分化的影響

任紅英，趙欽軍，王彤，程雪蓮，程濤(中國醫學科學院血液學研究所，實驗血液學國家重點實驗室，天津300020)

摘要：目的觀察不同缺氧條件對小鼠骨髓基質細胞(BMSC)成分組成的影響。方法Balb/c小鼠15只脫頸處死，取雙側股骨，分離BMSC接種于T25培養瓶中。將細胞隨機分為對照組、缺氧1組、缺氧2組、氯化鈷組。各組細胞分別以低密度(5×102/cm2)、中密度 (1×104/cm2)、高密度 (1.5×106/cm2)接種于培養基。對照組置于常氧條件(37 ℃、5% CO2、21%O2)培養，缺氧1組于2.5%～4%O2、5%CO2、91%～92.8%N2條件下培養，缺氧2組置于7%～8%O2、5%CO2、87%～88%N2條件下培養。氯化鈷組在培養基中加入氯化鈷 100 μΜ/L。各組細胞培養7 d后觀察結果。光鏡及透射電鏡下觀察BMSC細胞形態和超微結構變化，免疫組化法檢測細胞中堿性磷酸酶(ALP)表達，RT-PCR法檢測OCT4及內皮細胞相關基因(VEGF、FLT-1、FLK-1)表達。結果對照組以梭形成纖維樣細胞為主，少有細胞融合現象；缺氧1、2組出現較多個體較大、扁平而寬闊的骰子樣細胞；氯化鈷組細胞呈圓形，個體較小。缺氧1組BMSC增殖率高于缺氧2組；中密度接種細胞增殖率最高；氯化鈷組細胞增殖受到明顯抑制。缺氧1、2組ALP染色陽性細胞多于對照組及氯化鈷組，且缺氧1組高于缺氧2組(P均<0.05)。缺氧1、2組OCT4基因表達受到抑制，僅對照組及氯化鈷組OCT4基因表達陽性。VEGF在缺氧1、2組表達均為陰性，而在氯化鈷組表達陽性；各組FLK-1基因表達均為陽性；FLT-1基因表達均為陰性。結論在2.5%～4%O2、1×104/cm2接種密度條件下，小鼠BMSC中一種分化程度較高、寬闊、扁平、ALP表達陽性的細胞比例進一步增高。

關鍵詞：缺氧；骨髓基質細胞；細胞分化

骨髓基質細胞(BMSC)是一群成分復雜的混合細胞，由兩群形態差別較大的細胞組成，一群為紡錘樣的長梭形細胞(RS)；另一群細胞個體較大，形態扁平、寬闊呈骰子形，這群細胞被認為分化程度較高。正常氧(21% O2)條件下培養時，前者占絕大多數，后者比例很小[1]，但后者細胞個體較大、胞質伸展，是許多造血細胞黏附、增殖和形成克隆的重要場所。因此，將該類細胞從骨髓中分離出來，研究其生物學特點和功能，將為骨髓造血調控研究提供重要依據。我們前期研究發現，缺氧培養可使小鼠BMSC中這類形態扁平、寬闊、個體較大的細胞比例增高，同時該類細胞堿性磷酸酶(ALP)染色陽性[2]。2010年8月～2014年10月，我們觀察了不同缺氧條件對BMSC成分組成的影響，以期獲得更高比例的目標細胞，現報告如下。

1材料與方法

1.1實驗動物與材料Balb/c小鼠15只，8～12周齡，雌雄各半(中國醫學科學院動物中心提供)。IMDM培養基購自Gibco公司。胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(trypsin)為Hyclone公司產品。ALP檢測試劑盒購自中國醫學科學院血液學研究所科技公司。

1.2實驗方法

1.2.1小鼠BMSC的分離 Balb/c小鼠脫頸處死，消毒后取雙側股骨，自中間剪斷后用IMDM沖出骨髓細胞，計數并調整細胞密度，接種于T25培養瓶中。分別置于37 ℃、5% CO2、21%O2常氧條件和不同濃度缺氧條件下培養，24 h后傾倒懸浮細胞上清液。以后每2～3 d半量換液。待原代培養的細胞鋪滿整個培養瓶底的70%～80%開始傳代培養。流式細胞術行CD44、CD29、CD34、CD31、CD45表型檢測以鑒定BMSC[2]。

1.2.2細胞分組與處理將BMSC隨機分為對照組、缺氧1組、缺氧2組、氯化鈷組。各組細胞分別以低密度(5×102/cm2)、中密度(1×104/cm2)、高密度(1.5×106/cm2)接種于培養基(IMDM+10%FBS)。對照組置于常氧條件(37 ℃、5% CO2、21%O2)培養。缺氧1組將原代培養的BMSC置于密閉缺氧罐中注入2.5%～4%O2、5%CO2、91%～92.8%N2的混合氣體5 L/min×5 min，夾閉5 min后再次通氣，如此反復3次后夾閉，將密閉缺氧罐置于37 ℃、5%CO2孵箱內培養到指定時間。缺氧2組置于7%～8%O2、5%CO2、87%～88%N2條件下培養，操作過程參考缺氧1組。氯化鈷組在培養基中加入氯化鈷 100 μΜ/L。各組細胞培養7 d后觀察結果。

1.2.3細胞形態及超微結構觀察普通光學顯微鏡下觀察BMSC細胞形態。收集原代培養7 d的細胞懸液以2 000 r/min離心10 min，使細胞成團，經2．5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，乙醇系列脫水，Epon812包埋及LKB-11超薄切片機切片，在JEOL-1200EX透射電鏡下觀察并拍照，觀察細胞超微結構。

1.2.4細胞增殖測定每天在倒置顯微鏡下觀察細胞形態，培養7 d，將各組BMSC消化后采用胎盤藍拒染實驗計數，并與對照組進行比較，計算細胞增殖率=實驗組細胞計數-對照組細胞數/對照組細胞數×100%。

1.2.5細胞ALP檢測將BMSC原代培養8～9 d的蓋玻片取出，0.1 mmol/L PBS洗滌2次。用吹風機快速吹干，并以4%多聚甲醛固定10 min后，采用免疫組化法檢測ALP，嚴格按說明書操作。ALP陽性染色主要位于BMSC中一種個體較大的扁平細胞質內，胞質呈淡紫色染色為陽性結果，呈黃色為陰性結果。

1.2.6OCT4基因及內皮細胞相關基因檢測MSC培養7 d后，采用RT-PCR法檢測。提取各組細胞總RNA，OCT4基因上游引物序列為5′-TGGCATACTGTGGACCTCAGGTT-3′，下游引物序列為5′-TTTCCAAAGAGAACGCCCAGGG-3′，擴增產物長度為319 bp；FLT-1上游引物序列為 5′-TGTGGAGAAACTTGGTGACCT-3′，下游引物序列為 5′-TGGAGAACAGCAGGACTCCTT-3′，產物長度504 bp;FLK-1 上游引物序列為5′-AGAACACCAAAAGAGAGGAACG-3′，下游引物序列為 5′-GCACACAGGCAGAAACCAGTAG-3′，產物長度383 bp; VEGF上游引物序列為5′-GCAGGCTGCTGTAACGATGAAG-3′，下游引物序列為5′-CAAGGCTCACAGTGATTTTCTGGC-3′，產物長度185 bp。PCR條件為：93 ℃預變性3 min，隨后93 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共進行35個循環，再于72 ℃延伸7 min。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.3統計學方法采用SPSS10.0統計軟件分析。率的比較用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1細胞形態與超微結構光鏡下對照組以梭形成纖維樣細胞為主，少有細胞融合現象；缺氧1組、缺氧2組出現較多個體較大、扁平而寬闊的骰子樣細胞；氯化鈷組細胞呈圓形，個體較小。電鏡下(4 000×)，對照組細胞核以梭形為主，細胞以較長的梭形形態居多，BMSC超微結構清晰，線粒體嵴排列規則，異染色質均勻；缺氧1、2組細胞形態扁平、寬闊者比例較高，以寬闊、圓形細胞核為主，且核仁較大，多數細胞表現為分化程度增高，細胞器相對完整，細胞質內空泡明顯增多；氯化鈷組細胞形態較小，細胞核圓形，細胞內空泡很少。

2.2細胞增殖率在BMSC不同接種密度條件下，細胞增殖率有明顯差別，以中密度(1×104/cm2)接種者細胞增殖最為明顯，缺氧1組細胞增殖率高于缺氧2組；而氯化鈷組增殖受到明顯抑制。詳見表1。

組別細胞增殖率低密度接種中密度接種高密度接種缺氧1組19.6±14.240.1±4.7#*7.8±4.5#缺氧2組10.2±4.127.2±4.7*4.8±3.7氯化鈷組0-65.3±5.3-73.3±8.9

注：與缺氧2組同一密度相比，#P<0.05；與同組低、高密度接種者相比，*P<0.05。

2.3ALP及OCT4基因表達缺氧1組、缺氧2組ALP陽性細胞率高于對照組及氯化鈷組，且缺氧1組高于缺氧2組，氯化鈷組低于對照組(P均<0.05，見表2)。缺氧1、2組OCT4基因表達受到抑制，僅對照組及氯化鈷組OCT4基因表達陽性。

組別ALP染色陽性細胞率低密度接種中密度接種高密度接種缺氧1組5.8±1.621.60±2.3*#10.40±2.3*缺氧2組3.8±1.411.50±1.9*6.80±2.5氯化鈷組- 0.48±0.0*0.29±0.1對照組1.9±0.34.50±0.42.80±0.5

注：與對照組同一密度組相比，*P<0.05；與缺氧1組、缺氧2組同一接種密度組相比，#P<0.05。氯化鈷低密度接種組由于大部分細胞突起脫落，活細胞數目少，故未計算數據。

2.4內皮細胞相關基因表達VEGF在缺氧1、2組表達均為陰性，而在氯化鈷組表達陽性；各組FLK-1基因表達均為陽性，FLT-1基因表達均為陰性。各組內皮細胞相關基因表達差異不大。

3討論

ALP染色在血細胞特征研究中有重要作用[10]，正常的BMSC中ALP表達較少,而缺氧促進該類細胞中ALP高表達，ALP高表達與細胞分化程度增高相一致。ALP檢測可能成為純化目標細胞的一種方法。本研究中，缺氧1組較缺氧2組、對照組BMSC中ALP陽性率升高，說明該缺氧條件可使ALP陽性表達的細胞增多。OCT4基因是未分化細胞的重要標志，在胚胎干細胞和BMSC中均有表達[11,12]，由于早期的MSC還包括第三群細胞即非常小的圓形細胞，具有快速自我更新能力[1]，其可能與BMSC OCT4基因表達陽性有關。本研究發現，缺氧1、2組OCT4基因表達丟失，而缺氧模擬物氯化鈷不能抑制OCT4基因表達，說明缺氧促進了BMSC的分化，而氯化鈷沒有該作用。

缺氧能上調許多基因表達，特別是與血管新生和造血有關的基因表達[13,14]。缺氧可促進血管新生，使內皮細胞增殖，而骨髓基質中有內皮細胞存在，有報道1% O2處理可誘導BMSC中VEGF表達和血管形成[15,16]。本研究結果顯示，各組BMSC均表達FLK-1基因，該基因產物VEGF2受體在介導VEGF促進內皮細胞分化、增殖及造血細胞發育方面起重要作用。FLK-1基因在BMSC中表達，說明在合適的外界刺激下，BMSC有分化成內皮細胞從而形成血管的潛能。我們進一步觀察發現，3% O2處理的BMSC并不表達VEGF基因，從而無法誘導血管形成。但缺氧模擬物氯化鈷處理卻能使VEGF基因表達上調，所以氯化鈷具有一定的模擬缺氧的作用。FLT-1基因與內皮細胞重排和血管平滑肌細胞增殖有關，各組FLT-1基因表達均為陰性表明骨髓中多以血竇為主，而真正有功能的血管形成需要多種因素參與，特別是細胞外基質成分共同作用。因此，不同缺氧濃度的選擇對BMSC分化和細胞成分組成的影響不同，氯化鈷亦不能完全模擬缺氧的作用。

總之，本研究設定了不同的缺氧培養條件，從BMSC中獲得更高比例寬闊、扁平及ALP表達陽性的細胞，并證明該類細胞能夠在較低的缺氧條件下增殖。綜合本研究結果，我們認為3%～4%O2、1×104/cm2細胞接種密度對于BMSC分化篩選效果更好。然而，對于目標細胞缺氧耐受性產生的機制仍不清楚，今后有望通過深入研究缺氧條件下BMSC中表面分子和信號通路的變化來闡明其耐受原因，進一步了解缺氧對BMSC的影響，尋找更合理的純化目標細胞的方法。

參考文獻：

[1] Colter DC, Sekiya I, Prockop DJ, et al. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells[J]. Proc Natl Acad Sci, 2001,98(14):7841-7845.

[2] Ren H, Cao Y, Zhao Q, et al. Proliferation and differentiation of bone marrow stromal cells under hypoxic conditions[J]. BBRC, 2006,347(1):12-21.

[3] Harrison JS, Rameshwar P, Chang V, et al. Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers[J]. Blood, 2002,99(1):394.

[4] Parmar K, Mauch P, Vergilio JA, et al. Distribution of hematopoietic stem cells in the bone marrow according to regional hypoxia[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2007,104(13):5431 -5436.

[5] Fiegl M, Samudio I, Clise-Dwyer K, et al. CXCR4 expression and biological activity in acute myeloid leukemia are dependent on oxygen partial pressure[J]. Blood, 2009,113(7):1504-1219

[6] Maxwell PH, Dachs GU, Gleadle JM, et al. Hypoxia inducible factor-1 modulates gene expression in solid tumors and influences both angiogenesis and tumor growth[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997,94(15):8104-8109.

[8] Lennon DP, Edmison JM, Caplan AI. Cultivation of rat marrow derived- mesenchymal stem cells in reduced oxygen tension: effects on in vitro and in vivo osteochondrogenesis[J]. J Cell Physiol, 2001,187(3):345-355.

[9] Jiang BH, Semenza GL, Bauer C, et al. Hypoxia-inducible factor 1 levels vary exponentially over a physiologically relevant range of O2 tension[J]. Am J Physiol, 1996,271(4):1172-1180.

[10] Quesenberry P, Song ZX, McGrath E, et al. Multilineage synergistic activity produced by a murine adherent marrow cell line[J]. Blood,1987,69 (3):827-835.

[11] Tang N, Wang L, Esko J, et al. Loss of HIF-1alpha in endothelial cells disrupts a hypoxia-driven VEGF autocrine loop necessary for tumorigenesis[J]. Cancer Cell, 2004,6(5):485-495.

[12] Ramírez-Bergeron DL, Runge A, Dahl KD, et al. Hypoxia affects mesoderm and enhances hemangioblast specification during early development[J]. Development, 2004,131(18):4623-4634.

[13] Rehn M, Kertész Z, Cammenga J. Hypoxic induction of vascular endothelial growth factor regulates erythropoiesis but not hematopoietic stem cell function in the fetal liver[J]. Exp Hematol， 2014,[Epub ahead of print].

[14] Regan JN, Lim J, Shi Y, et al. Up-regulation of glycolytic metabolism is required for HIF1α-driven bone formation[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2014,111(23):8673-8678.

[15] Millman JR, Tan JH, Colton CK. The effects of low oxygen on self-renewal and differentiation of embryonic stem cells[J]. Curr Opin Organ Transplant, 2009,14(6):694-700.

[16] Sch?ler HR, Hatzopoulos AK, Balling R, et al. A family of octamer-specific proteins present during mouse embryogenesis:evidence for germline-specific expression of an Oct factor[J]. EMBO J, 1989,8(9):2543-2550.

Effect of different hypoxic conditions on the cell constituents of murine bone marrow stromal cells

RENHong-ying,ZHAOQin-jun,WANGTong,CHENGXue-lian,CHENGTao

(StateKeyLaboratoryofExperimentalHematology,InstituteofHematologyChinese

AcademyofMedicalSciences,Tianjin300020,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of different hypoxic conditions on the cellular constituents of mice bone marrow stromal cells (BMSC). MethodsFifteen Balb/c mice were taken off the neck to death, and bone marrow were collected from the femoral diaphysis. The isolated BMSC were plated in T25 culture flasks. The isolated bone marrow cells were randomly divided into control group, hypoxia 1 group, hypoxia 2 group, and COCl2group. BMSC in each group were seeded at low density(1×102/cm2), medium density(1×104/cm2), and high density(1×106/cm2) in culture medium. The control group cell was cultured at normoxic conditions(37 ℃，5% CO2，21%O2). The hypoxia 1 group cell was cultured at 2.5%～4%O2, 5%CO2and 91%～92.8%N2. The hypoxia 2 group cell was cultured at 7%～8%O2, 5%CO2, 88%～87%N2, as well as 100 μmol/L COCl2was added in COCl2group. The culture results were observed 7 days after seeding. The morphology and ultrastructure of BMSC were observed by light microscope and transmission electron microscope, and the expression of ALP was analyzed by immunohistochemistry. The OCT4 gene and endothelial cells relative genes (VEGF, FLT1, FLK1) were detected by RT-PCR. ResultsThe number of cells in hypoxic 1 group significantly increased compared to the control group and hypoxia 2 group, while COCl2inhibited the proliferation of BMSC. The morphology of BMSC in hypoxic group was wide, flat and big. The ultrastructure analysis showed that there were more vacuoles after under hypoxic conditions than the number under normoxic conditions. The proportion of ALP positive cells in BMSC under hypoxic culture increased compared to that under control group and hypoxia 2 group. However, the morphology of BMSC was small and round after COCl2treatment, and no ALP positive cells existed in COCl2group. Furthermore，hypoxia inhibited the expression of OCT4 gene, and can not increase the expression of endothelial cells relative genes such as VEGF, FLT1 and FLK1. Conclusion When plated at 1×104/cm2density under 2.5% to 4%O2concentration, a kind of BMSC cell type, which was wide, flat, ALP positive and high differentiated cell increased in the proportion of BMSC.

Key words:hypoxia; bone marrow stromal cells; differentiation

(收稿日期：2014-11-03)

作者簡介：第一任紅英(1976-)，女，碩士，副研究員，研究方向為缺氧和造血微環境。E-mail: hongying.ren@yahoo.com

基金項目：國家自然科學基金青年基金資助項目(81000196)。

中圖分類號：Q813

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)02-0020-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.02.007