小鼠足細胞Tbxa2r基因敲低方法探討

孔維信,鄧振興，張林，孫懷鑫，丁露露(上海交通大學醫學院蘇州九龍醫院，江蘇蘇州50；山東省醫學科學院附屬醫院)

·基礎研究·

小鼠足細胞Tbxa2r基因敲低方法探討

孔維信1,鄧振興2，張林1，孫懷鑫1，丁露露1(1上海交通大學醫學院蘇州九龍醫院，江蘇蘇州21502；2山東省醫學科學院附屬醫院)

摘要：目的設計并篩選對足細胞血栓素A2受體(Tbxa2r)基因表達敲低效果最佳的siRNA序列。方法培養永生性小鼠足細胞(MPC5)，取生長占培養板70%細胞用于實驗。設計4條siRNA序列(Tbxa2r-mus-1150、Tbxa2r-mus-1309、Tbxa2r-mus-1677、Tbxa2r-mus-1884)，經轉染效率驗證后轉染足細胞。將細胞分為四組：干擾組(以篩選出的干擾序列轉染細胞)、空白組(正常細胞樣品)、模擬組(只加轉染試劑的細胞樣品)、陰性對照組(轉染無序干擾系列的細胞樣品)。Real-time PCR檢測各組細胞Tbxa2r基因，Western blot法檢測Tbxa2r蛋白。結果篩選出干擾效果最強的siRNA序列Tbxa2r-mus-1677，其轉染24 h后對Tbxa2r基因表達干擾效果較小，而在轉染48 h后足細胞Tbxa2r基因相對表達量最低。轉染72 h后，細胞Tbxa2r蛋白相對表達量明顯降低。結論采用Tbxa2r特異性siRNA技術成功敲低足細胞Tbxa2r基因表達，并篩選出敲低效果最佳的siRNA序列。

關鍵詞：足細胞；血栓素A2受體基因；小分子RNA干擾技術；基因敲低

血栓素A2(TXA2)是花生四烯酸代謝過程中生成的產物。TXA2及血栓素受體激活參與血管緊張素Ⅱ依賴性高血壓、糖尿病腎病的發生發展[1]。有研究表明，血栓素合成酶抑制劑或血栓素受體拮抗劑對鏈脲佐菌素誘導的腎損傷、狼瘡性腎炎、環孢素腎毒性、殘余腎及腎移植物排異反應均有療效，但作用機制尚不明確[2]。2011年7月～2012年12月，我們設計了不同小干擾RNA(siRNA)序列，將小鼠足細胞TXA2受體(Tbxa2r)基因敲除或敲低，并對siRNA序列進行篩選，為進一步研究血栓素合成酶抑制劑或血栓素受體拮抗劑的作用機制奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1主要試劑RPMI1640培養基、10%胎牛血清、Trizol、重組干擾素-γ(IFN-γ)購自美國Sigma公司；反轉錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、轉染試劑Metafectene購自德國Biontex公司；兔抗小鼠Tbxa2r多克隆抗體、FITC標記的羊抗兔IgG、TRITC標記的羊抗兔IgG購自美國KPL公司；小鼠抗大鼠GAPDH多克隆抗體、HRP標記的羊抗兔IgG、兔抗羊IgG、羊抗小鼠IgG購自上海華美生物工程公司。

1.2小鼠足細胞培養條件永生性小鼠足細胞(MPC5)由Peter Mundel教授(美國Mount Sinia醫學院)饋贈。培養條件參照文獻[3]。取生長占培養板70%的細胞用于實驗。

1.3siRNA序列設計目標基因Tbxa2r基因序列從mRNA的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3′端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA 靶點。根據相關研究結果[4]，用Genepharma Desiger 2.0軟件輔助設計4條GC含量在30%～50%的siRNA序列，見表1。

表1　潛在靶點的siRNA序列設計

1.4細胞轉染與分組由于無法判斷足細胞是否能進行脂質體轉染，在實驗前先進行轉染效率評價：將熒光素Fam標記的siRNA以一定比例與陽離子脂質體Lipo2000分別按10 pmol/0.25 μL、10 pmol/0.5 μL、20 pmol/0.5 μL混合，混合物按脂質體轉染說明書進行實驗，通過熒光顯微鏡觀察siRNA進入細胞的數量及細胞生長狀態。選擇最合適的siRNA與脂質體混合比例，參照文獻[5]。將細胞分為四組：干擾組(以篩選出的干擾序列轉染細胞)、空白組(正常細胞樣品)、模擬組(只加轉染試劑的細胞樣品)、陰性對照組(轉染無序干擾系列的細胞樣品)。

1.5Tbxa2r基因及蛋白檢測

1.5.1Tbxa2r基因檢測Trizol試劑盒提取細胞總RNA，計算RNA濃度。瓊脂糖電泳檢查RNA的完整性。分別于轉染后24、48 h采用Real-time PCR法檢測Tbxa2r基因表達。以GAPDH和PPIA為內參。Tbxa2r mRNA上游引物序列為5′-GACTAAGGACGGAGCTACGACA-3′，下游引物序列為5′-TGAGCCTGGAGGAATGTGAA-3′，反應產物249 bp；GAPDH基因上游引物序列為5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物序列為5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′，反應產物123 bp。PPIA上游引物序列為5′-CAAATGCTGGACCAAACACAA-3′，下游引物序列為5′-GCCATCCAGCCATTCAGTCT-3′，反應產物71 bp。PCR反應體系：2× RT-PCR混合物10 μL，20 μmol/L上、下游引物各 0.1 μL，cDNA模板2 μL，5 U/μL r Taq DNA聚合酶 0.4 μL，雙蒸水定容至20 μL。反應條件：95 ℃ 3 min,95 ℃ 30 s，62 ℃ 40 s，共40個循環。溶解曲線檢測PCR引物的特異性，繪制熒光定量曲線。熒光曲線的起峰位置(即Ct值)初步判斷核酸濃度，核酸濃度越高，起峰位置越早，Ct值越低。利用模板Ct值與該模板的起始拷貝數呈對數線性關系，計算目標基因與內參基因的相對含量。

1.5.2Tbxa2r蛋白檢測分別于轉染后48、72 h采用Western blot法檢測Tbxa2r蛋白相對表達量，操作步驟參照文獻[5, 6]。

2結果

2.1細胞轉染情況熒光顯微鏡觀察結果顯示，當用0.5 μL Lipo2000與10 pmol siRNA、0.5 μL Lipo2000與20 pmol siRNA轉染細胞時，足細胞出現皺縮或脫落，對細胞生長影響較大；而0.25 μL Lipo2000與10 pmol siRNA的轉染效率為70%，此時細胞狀態和正常足細胞基本一致，故選擇該比例進行轉染。

2.2Tbxa2r基因表達Tbxa2r引物擴增產物溶解溫度為86～88 ℃，PPIA引物擴增產物為82～86 ℃，GAPDH引物擴增產物為86～88 ℃，證明所用PCR引物特異性良好，擴增的產物為目標基因。由熒光定量曲線可知，樣品中Tbxa2r基因含量極低，熒光曲線起峰位置在32個PCR循環左右，而內參基因PPIA和GAPDH的起峰位置均在16個循環左右。各干擾序列在轉染后24 h對目標基因表達幾乎沒有干擾效果。而在轉染后48 h時，第3條和第4條干擾序列轉染的細胞熒光曲線起峰位置向后推遲了兩個循環(說明存在一定干擾效果)。經計算，引物Tbxa2r-mus-1677干擾48 h后Tbxa2r基因相對表達量最低，為0.18，初步判定這條干擾序列作用效果最好。干擾系列對內參基因的含量影響不大。見表2。

表2　各組細胞Tbxa2r基因相對表達量

2.3Tbxa2r蛋白表達轉染后48 h，Tbxa2r蛋白表達豐度不高，但可以看出條帶，而在轉染后72 h，Tbxa2r蛋白表達量明顯降低。各組Tbxa2r蛋白相對表達量結果見表3。Real-time PCR結果與Western blot結果共同表明，Tbxa2r-mus-1677在轉染48 h時從mRNA水平下調足細胞Tbxa2r表達，在轉染72 h時，從蛋白水平下調Tbxa2r表達。

表3　各組細胞Tbxa2r蛋白相對表達量

3討論

RNA干擾技術是通過siRNA造成目的mRNA特異性降解，從而使基因轉錄后沉默的一種現象。這一現象廣泛存在于自然界，是生物進化過程中抵御外來基因侵害的一種機制，為穩定基因組發揮重要作用。RNA干擾是一種簡單、有效的代替基因剔除的遺傳工具，廣泛用于功能基因組學研究領域。研究表明，環氧合酶-2(COX-2)的表達與足細胞凋亡相關。Cheng等[7]認為足細胞COX-2過度表達可使細胞更易受到損傷。我們前期研究發現嘌呤霉素氨基核苷(PAN)可誘導足細胞凋亡，COX-2表達增加；進一步將足細胞COX-2基因敲除或敲低，發現經PAN誘導發生的足細胞凋亡較未敲低者明顯減輕[8～10]。COX-2基因敲低、表達減少或COX-2活性抑制，可導致下游的一種前列腺素物質即TXA2產生減少[11～18]，使后者對足細胞的損傷減輕。TXA2通過與其受體Tbxa2r結合發揮作用。Tbxa2r廣泛分布于不同組織器官的細胞膜及細胞內結構上，由7個跨膜區、3個細胞外袢和3個細胞內袢組成。Tbxa2r與TXA2結合后，可引起與受體偶聯的G蛋白發生變構，激活細胞內信號轉導系統，調節細胞代謝，引起血小板聚集和血管平滑肌收縮，進一步參與血管緊張素Ⅱ依賴性高血壓、糖尿病腎病的發生發展[1]。

本課題組在前期實驗的基礎上進行了Tbxa2r siRNA實驗，將足細胞Tbxa2r基因敲除或敲低。由于TXA2有很強的生理活性，如將Tbxa2r基因敲除則可能干擾足細胞的正常功能，因此我們選擇足細胞Tbxa2r基因敲低，維持其基礎的基因表達。我們采用siRNA技術，首先根據轉染效率篩選出最合適的脂質體與siRNA反應比例(0.25 μL Lipo2000與10 pmol siRNA)，照此比例將合成的4條siRNA轉染小鼠足細胞。PCR熒光定量曲線結果顯示，第三條siRNA序列(Tbxa2r-mus-1677)在轉染后48 h對Tbxa2r基因的敲低效果最好。將此干擾序列轉染細胞，得到實驗所需的干擾組，再與空白組(正常細胞樣品)、模擬組(只加轉染試劑的細胞樣品)、陰性對照組(轉染無序干擾系列的細胞樣品)比較發現，Tbxa2r-mus-1677干擾48 h后Tbxa2r基因相對表達量最低(為0.18)；轉染48、72 h后，Tbxa2r蛋白表達豐度不高，而在轉染后72 h表達明顯降低。以上結果表明，Tbxa2r-mus-1677相應的siRNA序列對小鼠足細胞中的Tbxa2r有最好的敲低效果，其在轉染后48 h時下調Tbxa2r基因表達，轉染后72 h下調Tbxa2r蛋白表達。

本研究采用Tbxa2r特異性siRNA技術，成功敲低小鼠足細胞中Tbxa2r基因表達，并篩選出敲低效果最強的siRNA序列，為特異性Tbxa2r拮抗劑干預足細胞凋亡相關的實驗研究奠定了基礎。

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(收稿日期：2014-07-22)

通信作者：鄧振興

基金項目：蘇州市科技計劃項目(SYSD2011070)。

中圖分類號：R329.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)02-0024-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.02.008