青島兩所醫院鮑曼不動桿菌碳青霉烯酶基因及同源性分析

李 茜，李慶淑，李 智，曲 彥，胡 丹

（青島大學醫學院附屬青島市立醫院，山東 青島 266071）

鮑曼不動桿菌（Acinetobacterbaumannii，AB）是一種非發酵的革蘭陰性條件致病菌，可引起各組織和器官感染，包括肺炎、腦膜炎、菌血癥、尿路感染和傷口感染等［1］。碳青霉烯類抗生素具有廣譜抗菌活性，是目前臨床上治療重癥感染的主要抗菌藥物。但近年來，隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛應用，對碳青霉烯藥物耐藥的AB已在全球流行，其治療已成為世界性難題，對其耐藥機制的研究具有重要意義。產碳青霉烯酶是AB對碳青霉烯耐藥的重要原因，水解藥物的碳青霉烯酶主要有B類金屬酶和D類OXA型酶。為了解青島市兩所醫院AB耐藥情況及碳青霉烯酶基因攜帶情況，筆者對臨床收集的145株AB進行耐藥分析，檢測其碳青霉烯酶基因攜帶情況，并進行同源性分析，了解菌株耐藥性的演變和耐藥基因分布，為臨床抗菌藥物的合理使用，預防和控制醫院感染流行提供可靠依據。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 收集青島市兩所醫院2013年7月—2014年7月住院患者臨床標本分離的AB，共145株，其中A院78株，B院67株，剔除同一患者相同部位重復分離株。質控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 藥敏試驗 采用紙片擴散法測定細菌對抗菌藥物的敏感性，試驗結果判斷參照美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）2012年標準。

1.3 細菌DNA模板制備 取菌環挑取單一菌落置于LB液體培養液中，在搖箱中過夜培養（37℃，180 r/min），取 渾濁的菌液于1.5 mL EP 管 內，6 000 r/min離心10 min，棄上清，向EP管內加入200μL高壓超純水，吹打混勻后100℃水浴10 min，隨后4℃冷卻5 min；4℃，12 000 r/min離心3 min；吸取上清液移入另一新的0.5 mL EP管內，即為聚合酶鏈反應（PCR）檢測模板，-20℃冰箱保存備用。1.4 基因檢測 PCR反應體系為25μL，含3μL DNA模板，0.2μL Taq酶，2.5μL10×Taq緩沖液（含15 mmol/L MgCl2），2μL2.5 mmol/L dNTP，10μmol/L上下游引物各1μL，15.3μL水。PCR反應條件:94℃預變性5 min；94℃變性30 s，退火30 s（溫度51～58℃），72℃延伸60s，共35個循環；最后72℃延伸10 min。腸桿菌基因間一致重復序列（ERIC）-PCR反應條件:94℃預變性5 min，94℃變性1 min，45℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個循環后，72℃延伸10 min。產物長度＜500 bp，采用2%瓊脂糖凝膠進行電泳；產物長度＞500 bp，采用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳，紫外投射儀觀察結果。各靶基因引物序列見表1。

表1 PCR引物序列及產物長度Table 1 The sequences of PCR primers and length of products

1.5 統計分析 應用SPSS 19.0軟件進行統計分析，采用秩和檢驗對兩院AB耐藥情況進行比較，χ2檢驗對兩院耐藥基因攜帶率進行比較，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 標本類型及科室分布 兩所醫院標本主要分離自痰（A院75.64%，B院85.07%）、分泌物（A 院11.54%）、組織、引流液、尿、導管末端、胸腔積液等。A院標本主要分離自重癥監護室（ICU，37.18%）、高壓氧病區（15.38%）、干部病房（12.82%）和手外科（8.97%）；B院標本主要分離自ICU（79.10%）和呼吸科（8.96%）。

2.2 藥敏結果 A院碳青霉烯耐藥AB68株，敏感10株；B院碳青霉烯耐藥AB60株，敏感7株。A院AB對頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率最低（3.85%），其次是米諾環素（16.67%）；對其他抗菌藥物耐藥率均＞73%。B院AB對米諾環素和替加環素均不耐藥，對阿米卡星和左氧氟沙星的耐藥率分別為23.88%、38.81%，對其他抗菌藥物的耐藥率均＞64%。兩院菌株對哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、慶大霉素的耐藥率比較，差異無統計學意義；其他抗菌藥物耐藥率比較，差異均有統計學意義。見表2。

表2 兩院AB耐藥情況比較（株）Table 2 Comparison in antimicrobial resistance of AB between two hospitals（No.of isolates）

2.3 PCR擴增結果 兩院所有菌株均攜帶OXA-51基因，均未檢出SIM-1、IMP-1、IMP-2、VIM-1、VIM-2、OXA-24基因。A、B兩院碳青霉烯耐藥組OXA-23基因的攜帶率分別為 86.76%（59/68），56.67%（34/60），差異有統計學意義（χ2＝14.53，P＜0.001）；兩院碳青霉烯敏感組OXA-23基因均為陰性。A院3株菌攜帶OXA-58基因，B院未檢出OXA-58基因。電泳結果見圖1。

2.4OXA-23基因陽性與陰性株耐藥率 除頭孢哌酮/舒巴坦、米諾環素、頭孢呋辛外，A院OXA-23基因陽性株和陰性株對其他抗菌藥物的耐藥率差異均有統計學意義（均P＜0.05）；除亞胺培南、美羅培南、左氧氟沙星、頭孢哌酮/舒巴坦及哌拉西林/他唑巴坦外，B院OXA-23基因陽性株和陰性株對其他11種抗菌藥物的耐藥率比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見表3。

圖1 AB碳青霉烯酶基因檢測PCR產物電泳圖Figure 1 Electrophoresis results of PCR products of AB carbapenemase genes

表3 兩院AB對常用抗菌藥物的耐藥率（%）Table 3 Antimicrobial resistant rates of AB from two hospitals（%）

2.5 同源性分析 根據ERIC-PCR擴增產物的電泳帶型（見圖2），運用BIO-1D軟件分析各菌株所有條帶分子量大小進行聚類分析。兩院所有菌株共分為8個基因型（分別用 A、B、C、D、E、F、G、H 表示），其中A型71株和E型37株，為主要流行株。A型又分為4個亞型，E型分為3個亞型。聚類分析見圖3。A院菌株共分為6種類型（除D、F型）主要是 A 型（46.15%）和E型（41.03%）；B院共分為8種類型，主要是 A 型 （52.24%）和 C 型（17.91%）。見表4。

表4 兩院AB基因分型構成Table 4 Constituent ratios of genotypes of AB from two hospitals

圖2 AB ERIC-PCR擴增產物電泳圖Figure 2 Electrophoresis results of ERIC-PCR in AB strains

圖3 基于ERIC-PCR譜型的兩院AB聚類分析結果Figure 3 Hierarchical clustering of AB strains from two hospitals based on ERIC-PCR electrophoresis patterns

3 討論

AB是醫院感染的重要病原菌，隨著抗菌藥物的廣泛運用，其耐藥株逐年增加，并且開始由低耐藥向高耐藥，單一藥耐藥向多藥耐藥方向發展，世界各地也陸續出現有關多重耐藥 AB（multidrugresistantAcinetobacterbaumannii，MDR-AB）或泛耐藥 AB（extensively drug-resistantAcinetobacter baumannii，XDR-AB）的報道［2］。本研究顯示，兩院分離的AB主要來源于痰標本，表明AB在兩所醫院主要為下呼吸道感染；其在ICU分離率較高，可能與患者自身多有嚴重疾病、免疫能力較差，且長期使用廣譜抗菌藥物及侵入性操作（如氣管插管、氣管切開、吸痰、靜脈置管）等有關。池細俤等［3］采用多因素回歸分析結果顯示，氣管切開和使用呼吸機是MDRAB感染的獨立危險因素。另外A院的高壓氧病區和干部病區的AB分離率也較高，可能與手衛生差、抗菌藥物使用不合理、侵入性操作、年齡等有關。

兩院AB耐藥性分析顯示，耐藥情況嚴重，呈現多重耐藥和泛耐藥。對氨基青霉素、第一代和第二代頭孢菌素、第一代喹諾酮類抗菌藥物幾乎完全耐藥；對舒巴坦復方制劑仍有較高的敏感性，可能與舒巴坦能直接作用于青霉素結合蛋白，并可以抑制細菌產生多種β-內酰胺酶有關［4］。兩院菌株耐藥情況比較對亞胺培南、美羅培南、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、慶大霉素差異無統計學意義，對其他抗菌藥物差異均有統計學意義，可能與兩院環境及抗菌藥物選擇不同有關。

目前，關于AB對碳青霉烯類藥物耐藥機制中產碳青霉烯酶的相關報道［5-7］最多。碳青霉烯酶是指能夠水解碳青霉烯類藥物的1類β-內酰胺酶，在我國主要是B類酶和D類酶。國際上，該菌所產的B類金屬酶主要有IMP型、VIM型及SIM-1型，D類 OXA 型酶主要為OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58。報道［8］稱OXA-51/66是AB天然固有的碳青霉烯酶基因。本實驗中所有菌株均攜帶OXA-51基因，再次證明所有菌株均為AB。OXA-23基因在碳青霉烯敏感組中均為陰性，而耐藥組中OXA-23基因攜帶率兩院相比差異有統計學意義。此外OXA-23基因與某些抗菌藥物的耐藥情況有一定關聯性，陽性菌株耐藥率高于陰性株；且兩院存在一定的差異，可能尚存其他多種耐藥機制，有待進一步研究。B類金屬酶基因SIM-1、IMP-1、IMP-2、VIM-1、VIM-2及OXA-24基因在兩院中均為陰性，與國內其他地區報道［9-10］一致。A院3株 AB攜帶OXA-58基因，B院菌株OXA-58基因均為陰性。以上結果提示，兩院AB對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制與產D類碳青霉烯酶有關，且主要產OXA-23與OXA-51型酶，尚未發現B類金屬酶基因。

耐碳青霉烯AB的出現，使臨床治療和預防感染面臨很大挑戰，監測其耐藥率和流行型別十分重要。ERIC-PCR是目前常用的簡便、快速的基因分型技術，其分辨率較強，結果可靠，與細菌分子生物學分型技術的“金標準”脈沖場凝膠電泳（PFGE）分型有一定相關性［11］。ERIC-PCR的擴增產物多為一端有ERIC序列，而另一端為隨機序列，小部分產物兩端均為隨機序列，可根據擴增產物條帶位置分析基因的同源性。本研究中，兩院所有菌株共分為8個基因型，其中A型71株和E型37株，為主要流行株。A院主要流行A型和E型，主要分布在ICU、呼吸內科、高壓氧病區；B院主要流行A型和C型，主要分布在ICU、呼吸內科；其余型別以散發形式存在。A院3株OXA-58基因陽性株分屬不同類型，說明A院未出現攜帶OXA-58基因的AB水平傳播。其中A、B、C、D四個克隆型的譜帶有較高程度的相似性，它們間的親緣關系緊密。對于這些親緣關系較近的菌株，可能來自于同一感染源或為某克隆系在外界環境條件的影響下分化形成的不同克隆型及亞型，具有追溯感染源的意義。A型菌株在兩所醫院均存在暴發流行，應深入研究這些攜帶A型菌株患者的臨床資料，探討是否因為相同或相似的臨床感染、用藥模式、傳播途徑等而分離出相同的細菌菌型。此外，ERIC分型的每一種型別均分散著OXA-23基因陽性株與陰性株，故認為攜帶此耐藥基因與ERIC分型不一致，可能與細菌合并多種耐藥機制，并可通過整合子等移動元件進行水平傳播有關。以上結果提示在這一時期內，兩所醫院存在某種MDRAB的暴發流行，可能以克隆株的形式在病房內和病房間，甚至醫院間進行傳播，這可能是造成兩院MDRAB分離率及耐藥率逐年升高的重要原因。

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